吳小霞 許天委 李國寅 程睿菁

(瓊臺師范學院數(shù)理系 海南海口 571127)

除AID(Activation-induced cytidine deaminase，活化誘導的脫氨酶，簡稱AID)外，所有的哺乳動物都有至少4個APOBEC(apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic polypeptide-like，載脂蛋白BmRNA編輯酶催化樣蛋白，簡稱APOBEC)基 因 ，即APOBECs1、APOBEC2、APOBEC3和APOBEC4[1-2]。APOBECs是脊椎動物一個可抑制胞嘧啶脫氨酶家族，主要在各種類型的細胞中進行固有免疫應答，在單鏈DNA中產(chǎn)生作用，將DNA或RNA的胞嘧啶C轉(zhuǎn)化U，使得DNA復制時出現(xiàn)G向A的超突變[3-5]。

AID和A2可能是祖先成員，A1和A3是經(jīng)進化產(chǎn)生的，而A3s只在有胎盤的哺乳動物中出現(xiàn)，其基因拷貝數(shù)有物種特異性。例如，小鼠只有1個A3基因，豬有2個A3基因，綿羊和牛有3個A3基因，貓有4個A3基因，馬有6個A3基因，而靈長類有7個A3基因[3]。

人類A3基因位于22號染色體，編碼APOBEC3A(簡稱A3A)、 APOBEC3B(簡稱A3B)、 APOBEC3C(簡稱A3C)、APOBEC3D(簡稱A3DE)、 APOBEC3F(簡稱A3F)、 APOBEC3G(簡稱A3G)及APOBEC3H(簡稱A3H)等7個蛋白[4-6]， 其中A3A、A3C和A3H只有一個胞嘧啶脫氨酶域，而A3B、A3DE、A3F和A3G有2個脫氨酶域。A3蛋白在不同組織和細胞中廣泛表達，尤其是在HIV-1的靶細胞中，例如CD4+T細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞[7]。

在大量野生型小鼠組織中也檢測到A3mRNA，其中胸腺和淋巴結(jié)中A3mRNA表達水平最高，暗示淋巴組織的優(yōu)先功能[1]。小鼠A3位于15號染色體，由14個外顯子組成，是小鼠固有免疫系統(tǒng)的重要組成成員。依據(jù)波長可將紫外線分為紫外線A(UVA，315～400nm)、 紫外線B(UVB， 280～315nm)和紫外線C(UVC，100～280nm)[8]。UVC是紫外線輻射中最具破壞性的類型，并可引起許多細胞的生理反應，UVC一直用于滅菌和消毒，并且暴露于UVC中產(chǎn)生的傷害程度正在增加。紫外光與人體健康密切相關，陽光下的紫外線會對皮膚、眼睛和免疫系統(tǒng)造成急性或慢性傷害，在全球范圍內(nèi)，大約有60 000人死于由紫外線照射引起的疾病，主要是惡性黑色素瘤[8]。

本研究通過對km小鼠實施3個月的UVC紫外線照射，利用熒光定量PCR研究小鼠A3mRNA表達水平的變化，為進一步了解機體對紫外線等誘變劑的應答機制提供參考，同時為深入了解癌癥發(fā)病機制等提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 小鼠

km小鼠雌、雄各5只，5-6周大，每只體重約25g。

1.1.2 試劑和儀器

RNA提取試劑盒(Thermo GeneJET RNA Purification Kit)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit、SYBR(ABI PowerUp SYBR Green Master Mix)購自海南山清科技有限公司。實驗中使用紫外燈(20W)、離心機(eppendorf 5424R)、PCR儀(stratagene mx3005p)、酶標儀(Biotek Synergy HTX)、全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)(Tanon-4100)。

引物為上海生工生物工程股份有限公司合成，MM-ACTB(174 bp)(F： GTGCTATGTTGCTCTAGACTTCG； R： ATGCCACAGGATTCCATACC)； MM-A3(92 bp)(F： CATGGAGCTGAGCCAAGTGA； R： GATCCCTTTTGAATGCCGCC)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組

本實驗分為4組，包括空白對照組(雄性小鼠2只、雌性小鼠2只)、實驗照射組(雄性小鼠3只、雌性小鼠3只)。

1.2.2 紫外線照射

實驗照射組小鼠每天用20W紫外燈(254 nm)照射20 min，連續(xù)照射3個月。

1.2.3 組織取樣

分別取各組小鼠的胸腺、淋巴結(jié)、肝臟、乳腺、骨髓、腎臟、膀胱、卵巢(雌性)、睪丸(雄性)并在-80℃凍存。

1.2.4 提取RNA

按照Thermo GeneJET RNA Purification Kit使用說明提取小鼠胸腺、淋巴結(jié)、肝臟、乳腺、骨髓、腎臟、膀胱、卵巢(雌性)及睪丸(雄性)組織中的RNA。首先，分別稱量30 mg冷凍組織，研缽搗碎，使用轉(zhuǎn)子-定子均質(zhì)器破壞和均勻化，加入600μL稀釋的蛋白酶K(10 μL的含蛋白酶K在590 μL的TE緩沖液中稀釋)；旋渦混合并在15～25℃孵育10 min；12 000×g離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移到不含RNase的微離心管中，加入450μL 100%乙醇溶液混合；轉(zhuǎn)移700μL的裂解物到插入收集管的純化柱(GeneJET RNA PurificationColumn)，12 000×g離心1 min，丟掉廢液，將純化柱重新放回收集管；向純化柱加入700μL洗滌Buffer1，12 000×g離心1 min，丟掉廢液，將純化柱重新放回收集管；向純化柱加入600μL洗滌Buffer2，12 000×g離心1 min，丟掉廢液，將純化柱重新放回收集管；向純化柱加入250μL洗滌Buffer2，12 000×g離心2 min；向純化柱的中間部位加入100μL無核酶的水，12000×g離心1 min；丟掉純化柱，于-70℃保存。

1.2.5 RNA檢測

先用TE溶液將分光光度計調(diào)零；然后取少量RNA溶液用TE稀釋(1∶100)，讀取其在分光光度計260 nm和280 nm處的吸收值，測定RNA溶液的濃度和純度，經(jīng)變性瓊脂糖凝膠電泳后，于紫外透射光下觀察并拍照。

1.2.6 RNA反轉(zhuǎn)錄

按照Thermo RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit說明書進行反轉(zhuǎn)錄。

1.2.7 熒光定量PCR

參照ABI PowerUp SYBR Green Master Mix說明書進行熒光定量PCR。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA檢測結(jié)果

結(jié)果顯示，分光光度計測定的樣品RNAOD260/OD280均在1.84～2.13。電泳圖見圖1，前面的是18S帶，后面的是28S帶，18S帶的密度大約是28S帶的2倍，而且溴酚藍附近的5S帶很弱，證明提取的RNA質(zhì)量很好。

圖1 RN A瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 引物特異性檢測

將電泳后的瓊脂糖凝膠在紫外透射光下觀察并拍照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2號泳道和4號泳道分別呈ACTIN陽性 和A3 92bp陽性，見圖2。

圖2 引物特異性檢測電泳圖

2.3 熒光定量PCR結(jié)果

利用ACTIN作為內(nèi)參基因，對小鼠的A3mRNA進行相對定量分析。結(jié)果顯示，空白雄性小鼠胸腺組織中A3mRNA的表達水平明顯低于空白雌性小鼠；照射雄性小鼠胸腺組織中A3mRNA的表達水平有所提高(照射雄鼠1和3的A3mRNA表達水平明顯提高，照射雄鼠2的A3mRNA表達水平較低)(圖3-A)；而照射雌性小鼠胸腺組織A3mRNA的表達水平顯著提高。本研究認為A3基因在小鼠胸腺組織中的表達穩(wěn)定而豐富，但是A3 mRNA在胸腺組織中的表達水平似乎與其性別有關。

A3mRNA在雌、雄空白小鼠淋巴結(jié)中的表達無明顯差異，照射雄鼠淋巴結(jié)中A3mRNA的表達有所提高，尤其是照射雄鼠3的A3mRNA表達水平明顯提高，而照射雌鼠淋巴結(jié)A3mRNA的表達也有所提高(圖3-B)。因此，本研究認為紫外線照射使得小鼠淋巴結(jié)A3mRNA的表達水平有所提高。

A3mRNA在空白小鼠肝臟組織穩(wěn)定表達，雌雄差異表達不太明顯，而紫外線照射后小鼠肝臟的A3mRNA表達水平下降(圖3-C)，表明3個月的紫外線照射對小鼠肝臟的傷害較為嚴重。

小鼠乳腺組織A3mRNA定量分析結(jié)果顯示，雌性空白小鼠A3mRNA的表達水平明顯高于雄性小鼠，紫外線照射后的雄性和雌性小鼠的A3mRNA表達水平都有所提高(圖3-D)。因此，本研究認為3個月的紫外線照射使得小鼠乳腺組織A3mRNA的表達水平有所提高。

另外，A3mRNA在雄性空白小鼠骨髓的表達可能要高于雌性小鼠，紫外線照射3個月后，雌雄小鼠骨髓中A3mRNA的表達水平與空白小鼠相比明顯下降(圖3-E)。所以本研究認為3個月的紫外線照射使得小鼠骨髓A3mRNA的表達水平下降。

小鼠腎臟組織A3mRNA定量分析結(jié)果顯示，A3mRNA在空白小鼠腎臟組織的表達較為穩(wěn)定，而紫外線照射后小鼠的A3mRNA表達水平呈現(xiàn)出一定的個體差異性(圖3-F)。因此，本研究認為3個月的紫外線照射對小鼠腎臟組織A3mRNA表達水平的影響具有個體差異。

小鼠膀胱A3mRNA定量分析顯示，空白雄性小鼠膀胱組織中A3mRNA的表達水平明顯低于空白雌性小鼠，照射雌性小鼠膀胱組織A3mRNA(圖3-G)的表達水平有所提高。因此，本研究認為3個月的紫外線照射使得 A3mRNA的表達水平提高，雌性小鼠A3mRNA的表達水平可能高于雄性小鼠。

小鼠性腺A3mRNA定量分析結(jié)果顯示，空白雌性小鼠卵巢組織中A3mRNA的表達量約為空白雄性小鼠睪丸組織的3倍，照射雄性小鼠睪丸組織中A3mRNA的表達水平有一定提高，而照射雌性小鼠卵巢組織A3mRNA的表達水平較空白雌鼠也有有所提高(圖3-H)。因此，本研究認為3個月的紫外線照射使得小鼠性腺組織 A3 mRNA的表達水平提高，且雌性小鼠A3mRNA的表達水平可能高于雄性小鼠。

4 討論

圖3 小鼠不同組織A 3m RN A的定量分析

續(xù)圖3 小鼠不同組織A 3m RN A的定量分析

很多研究已表明哺乳動物A3是其固有免疫系統(tǒng)的一部分。在無A3的動物中，有效的F-MuLV感染細胞總數(shù)在脾臟和骨髓中增加10～100倍，骨髓來源的細胞是有效的M-MuLV感染所需的[9]。小鼠雖然只有一個A3基因，但小鼠A3可通過誘導病毒DNA中高水平的G突變?yōu)锳，具有與人類A3G一樣強大的ΔVifHIV-1限制能力。小鼠A3也有2個脫氨酶域，只是人類A3G缺乏脫氨酶活性的N端域是進入病毒所必須的，而其C端域卻具有脫氨酶活性。值得一提的是，小鼠A3的功能排列與人類A3G相反，即人類C端結(jié)構(gòu)域是進入病毒所必須的，而N端結(jié)構(gòu)域具有胞苷脫氨酶活性。

紫外線照射是一種機體突變誘變劑，可引起急性和慢性皮膚問題，如曬傷、色素沉著、免疫抑制、即將到來的刺激過敏、光老化和各種動物的癌癥[9]等。與UVB一樣，UVC可引起組織反應和DNA損傷，但其作用更明顯[9]。小鼠A3作為固有免疫系統(tǒng)的重要成員，在胸腺、乳腺、肝臟、性腺等組織穩(wěn)定表達，對生物抵御外來病毒等具有重要作用。

本研究證實小鼠胸腺組織、淋巴結(jié)、膀胱、性腺(雄性睪丸、雌性卵巢)、肝臟、乳腺組織、骨髓以及腎臟組織中有A3mRNA的表達。另外，空白小鼠中胸腺、乳腺、骨髓、膀胱以及性腺A3mRNA的表達有明顯的性別差異，雄性小鼠胸腺、乳腺、膀胱及性腺中A3mRNA的表達明顯低于雌性小鼠，而雄性小鼠骨髓中的A3mRNA的表達明顯高于雌性小鼠。而在肝臟、淋巴結(jié)和腎臟組中的A3mRNA表達性別差異不太明顯。紫外線照射后小鼠胸腺、淋巴結(jié)、膀胱、性腺以及乳腺組織中A3mRNA的表達顯著增加，而骨髓和肝臟中的A3mRNA的表達顯著降低；小鼠腎臟中A3mRNA的表達差異較大，照射雄鼠A3mRNA的表達可能是增加的，而雌鼠可能是降低的。

小鼠A3mRNA在胸腺組織和淋巴結(jié)穩(wěn)定表達并有顯著的性別差異，暗示作為中樞免疫器官的胸腺和外周免疫器官的淋巴結(jié)在小鼠應答紫外線傷害的反應中起著重要的作用，且雌性小鼠的免疫能力高于雄性小鼠。而在同為中樞免疫器官的小鼠骨髓中，A3mRNA的表達水平是顯著下降的，且雄性小鼠的下降水平極為明顯，這表明紫外線照射后對雄性小鼠的抵抗力影響更為明顯。紫外線照射使得雌性小鼠乳腺組織中A3的表達量明顯提高，表明乳腺組織在小鼠免疫應答中起一定作用，也表明雌性小鼠的免疫功能似乎強于雄性小鼠。小鼠膀胱與性腺組織中A3mRNA的表達暗示雌性小鼠A3mRNA的表達穩(wěn)步提高，而雄性小鼠A3的表達顯示出明顯的個體差異性。紫外線照射總體上降低小鼠肝臟組織中A3mRNA的表達水平，表明肝臟在紫外線照射中受到的傷害可能更為嚴重。紫外線照射是一種機體突變誘變劑，考慮到肝臟和骨髓在生物體中的重要作用，本研究認為小鼠肝臟和骨髓組織中A3mRNA的表達水平下降可能是紫外線照射使得機體肝臟和骨髓受到重創(chuàng)，從而誘發(fā)機體肝臟和骨髓發(fā)生相關的腫瘤。

總之，小鼠A3作為固有免疫系統(tǒng)的重要成員，在胸腺、乳腺、肝臟、性腺等組織穩(wěn)定表達，在應答機體受到紫外線傷害時，其mRNAs表達水平的變化表明A3確實發(fā)揮了重要作用。但是本研究中所選的樣本較少，對結(jié)果的準確性可能會產(chǎn)生影響，因此，若要進一步深入研究A3在紫外線照射中所起的作用，應選擇更多的樣本，才能為闡明機體的固有免疫應答機制以及治療相關疾病提供較好的參考價值。

5 結(jié)語

固有免疫系統(tǒng)是開啟抗病毒應答的第一道防線，A3作為APOBEC脫氨酶家族的成員之一，也在機體固有免疫應答反應中起重要作用[1-5,10]。人類A3有7個成員，小鼠只有1個A3。A3基因通過利用突變逆轉(zhuǎn)座子、外源病毒和內(nèi)源病毒廣泛參與固有免疫應答。紫外線是1種可導致基因突變的誘變劑，對生物體造成程度不一的傷害。本研究利用20 W紫外燈對普通野生型小鼠每天照射20 min，連續(xù)照射3個月，然后進行A3mRNA的相對定量分析。結(jié)果顯示,在小鼠胸腺、淋巴結(jié)、肝臟、乳腺、骨髓、腎臟、膀胱以及性腺組織中均檢測到了A3 mRNA；小鼠的胸腺、乳腺、骨髓、膀胱以及性腺中A3mRNA的表達具有較為明顯的性別差異，其中雌鼠胸腺、淋巴結(jié)、乳腺、膀胱及性腺組織A3mRNA的表達高于雄鼠，而雄鼠骨髓中的A3mRNA表達高于雌鼠；照射小鼠胸腺、淋巴結(jié)、膀胱、性腺以及乳腺組織中A3mRNA的表達顯著提高，而骨髓和肝臟中A3mRNA的表達明顯下降。這些數(shù)據(jù)顯示A3在小鼠免疫應答中起重要作用。