肖樂天

研究背景

獼猴桃植株栽培過程常因土壤中氮、鉀、磷等元素不足，導(dǎo)致植株生長緩慢、產(chǎn)量低、抗病能力弱，易發(fā)細(xì)菌性潰瘍等典型病害。而不合理施用化肥和農(nóng)藥又會帶來果品品質(zhì)下降、抗病性降低、農(nóng)殘超標(biāo)、土壤板結(jié)及環(huán)境污染等問題。

微生物肥料是以微生物的生命活動及其代謝產(chǎn)物為核心，使農(nóng)作物獲得特定肥料效應(yīng)的一類肥料制品。與化肥相比，微生物菌肥應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)優(yōu)勢明顯，如用量少、肥效持久、對人畜安全無毒、不污染環(huán)境，還能改善土壤結(jié)構(gòu)和保護(hù)土壤微生物多樣性等。不同種類作物需要的微生物菌肥種類也不盡相同，具體到獼猴桃栽培，目前還沒有相應(yīng)的專用菌肥產(chǎn)品。

球托霉菌W對土壤中有效氮、磷敏感，本次課題的研究目的就是研究其是否能作為微生物肥料以促進(jìn)獼猴桃生長。

研究過程

植株生長指標(biāo)測定：選擇120盆間苗移栽后獼猴桃植株，其中60盆用w5孢子懸浮液澆灌其培養(yǎng)基質(zhì)，使孢子密度達(dá)到1500個/cm3，60盆澆灌無菌水作為接種實驗的對照。澆灌接種后，每隔1個月隨機(jī)抽取處理組和對照組各6盆，用常規(guī)方法測定植株高度，待處理與對照株高有差異后，測定獼猴桃植株葉片數(shù)、莖粗、地上部分和根系鮮重，并使用根系掃描儀掃描測定葉面積、根面積等植株生長指標(biāo)。

葉片葉綠素含量及其熒光參數(shù)的測定：采用葉綠素測定儀對獼猴桃植株完全展開的第2對真葉進(jìn)行相對葉綠素含量測定。使用葉綠素?zé)晒鈨x測定獼猴桃植株完全展開的第2對真葉的葉綠素初始熒光（Fo）、最大熒光（Fm）、最大熒光與初始熒光差值（Fv）、PSII原初光能轉(zhuǎn)化效率（Fv/Fm）、PSII潛在活性（Fv/Fo）、非光化學(xué)淬滅值（NPQ）及光化學(xué)淬滅值（qP）。

獼猴桃葉片光合作用測定：使用光合儀測定獼猴桃葉片光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度及蒸騰速率。

W5接種后獼猴桃植株細(xì)菌性潰瘍病抗性測定：用無菌牙簽從獼猴桃植株細(xì)菌性潰瘍病菌株JF8單菌落挑取致病菌少量，戳刺獼猴桃實生苗莖部第1對真葉和第3對真葉之間，深達(dá)木質(zhì)部;用無菌水作對照，接種方法同上。將接種后的獼猴桃植株置于溫度20℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種后1周，觀察其發(fā)病情況。

除此之外，還分別對樣品進(jìn)行了糖含量測定、W5生長碳源測定、菌絲侵染率測定、根際土壤有效磷含量測定等。

結(jié)果與分析

接種w5對獼猴桃植株生長指標(biāo)的影響：接種w5菌株60天后，獼猴桃生長株高顯著高于對照組。此時對獼猴桃其他各項生理指標(biāo)進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，w5處理60天后獼猴桃植株葉片數(shù)、莖粗、地上部分和根系鮮重、葉面積、根面積等生理指標(biāo)均大于對照組獼猴桃。結(jié)果表明，接種w5至獼猴桃植株根部能夠促進(jìn)獼猴桃植株的整體生長，特別是根系和葉片的生長。

接種w5對獼猴桃植株光合作用的影響：處理組SPAD值（Soil and plant analyzer development，土壤與作物分析開發(fā)，指一種測量濃度的方法。葉綠素含量SPAD，指用SPAD法測量的葉綠素濃度）為22.572±1.148，顯著高于對照組的18.988±1.549，表明接種w5可增加植株葉片中葉綠素含量。對獼猴桃葉片葉綠素?zé)晒鉁y定結(jié)果顯示，對照組和實驗組的葉綠素初始熒光（Fo）、最大熒光（Fm）、最大熒光與初始熒光差值（Fv）差異不顯著然而，實驗組在Psn原初光能轉(zhuǎn)化效率（Fv/Fm）和光化學(xué)淬滅值（qP）顯著高于對照組，說明w5處理后提高了葉片葉綠素原初光能轉(zhuǎn)化效率。葉片的光合作用效率測定結(jié)果顯示，處理組獼猴桃葉片的胞間CO2濃度和蒸騰速率均顯著高于對照組，說明接種w5促進(jìn)了葉片的光合作用。

接種后獼猴桃植株對細(xì)菌性潰瘍病抗性測定結(jié)果：接種致病菌后10天開始觀察到葉片病斑，接種后15天，病斑顯著。接種1個月后測量莖上病斑面積，結(jié)果顯示，處理組潰瘍病病斑面積顯著小于對照組，說明其潰瘍病抗性高于對照組。

w5生長碳源：與葡萄糖和果糖相比，以蔗糖為碳源時，w5在液態(tài)培養(yǎng)條件下菌絲體增長最快，為最適碳源。w5菌株對不同碳源的利用效率為蔗糖>葡萄糖>果糖。

接種w5對獼猴桃植株糖含量影響：處理組葉片與對照組相比，果糖差異不顯著，但是葡萄糖和蔗糖含量均顯著增高。因處理組光合作用顯著高于對照組，而植物在葉片合成蔗糖后，大量的蔗糖會通過篩管的運輸運送到根系區(qū)域儲存，因此，處理組根部區(qū)域蔗糖含量顯著高于對照組蔗糖含量。

菌絲侵染率：w5處理后的獼猴桃植株根細(xì)胞及其間隙中存在有豐富的侵入菌絲及少量泡囊。結(jié)果表明，w5可通過與植株根系直接相互作用，促進(jìn)植株生長。

土壤有效磷含量：使用鉬銻抗比色法測得對照組獼猴桃根際土壤有效磷含量為7.576±0.331mg/kg，處理組為5.656±0.337mg/kg，處理組顯著低于對照組，說明接種w5促進(jìn)了獼猴桃植株對土壤磷的吸收。

討論與展望

本項目以w5菌株為對象，探討了其對獼猴桃植株生長的促進(jìn)作用和機(jī)制。結(jié)果顯示，接種w5菌株60天后獼猴桃植株在株高、葉面積、植株鮮重、地上及地下部分重量等方面均顯著高于對照組（P<0.05），說明w5可以顯著促進(jìn)獼猴桃植株生長，并增強(qiáng)對潰瘍病的抗性。

顯微觀察結(jié)果顯示，w5可入侵獼猴桃植株根系組織，與植物形成共生關(guān)系。文獻(xiàn)報道，對于菌根真菌，當(dāng)其與植物形成共生后，會誘導(dǎo)植物增強(qiáng)光合作用，更多的光合作用產(chǎn)物也會從葉片部位流向根系。我們檢測了接種w5的獼猴桃植株的光合作用效率，結(jié)果顯示，其葉片的葉綠素含量提高、葉綠素原初光能轉(zhuǎn)化效率增加、光合作用增強(qiáng)。相應(yīng)地，我們發(fā)現(xiàn)葉片中葡萄糖、蔗糖含量顯著提高，根部蔗糖含量也顯著增加。這都表明，與絕大多數(shù)菌根真菌類似，w5入侵獼猴桃根系組織后，可誘導(dǎo)植株光合作用增強(qiáng)及光合產(chǎn)物的重新分配。然而，菌根真菌（如叢枝菌根菌）因缺乏蔗糖轉(zhuǎn)化酶而無法直接利用蔗糖，只能通過植物自身將蔗糖水解為葡萄糖和果糖，然后利用單糖。與之不同的是，蔗糖是w5的最適碳源，其在蔗糖中的生長顯著優(yōu)于葡萄糖和果糖。因此我們推測，當(dāng)w5入侵獼猴桃根系后，大量利用根部組織中蔗糖進(jìn)行繁殖和生長，導(dǎo)致植株組織中蔗糖重新分布和積累，進(jìn)而誘導(dǎo)了葉片增強(qiáng)光合作用。

一般情況下，真菌與植物互惠共生關(guān)系中，微生物依賴于宿主植物提供碳源生長和繁殖，作為回饋，微生物則通過分解土壤中的難溶礦物和元素，將其轉(zhuǎn)化為易溶性物質(zhì)，促進(jìn)植物對礦物質(zhì)的吸收，促進(jìn)植物生長。本研究以土壤中的磷元素為例進(jìn)行了測定，實驗表明，處理組土壤中磷元素相較于對照組明顯減少，證明接種w5促進(jìn)了植株對土壤磷元素的吸收和利用。另外，作為非致病菌，w5菌株在定植于根系細(xì)胞從植物獲取能源物質(zhì)的同時，可能通過菌絲的擴(kuò)散增大與土壤接觸面積，從而促進(jìn)植物對土壤中氮、磷、鉀等礦物質(zhì)的吸收，增加植株營養(yǎng)，促進(jìn)植株生長，增強(qiáng)植株抗病性。后續(xù)，我們將測定接種w5前后獼猴桃根際土壤的其他礦物質(zhì)的含量變化，對不同的礦物質(zhì)進(jìn)行同位素標(biāo)記示蹤，進(jìn)一步驗證此假說。

本項目初步探討了球托霉菌w5對“紅陽”獼猴桃植株生長的影響及其作用機(jī)制，為獼猴桃真菌菌肥研發(fā)提供了實驗依據(jù)。關(guān)于球托霉菌促進(jìn)獼猴桃植株生長和抗病害的精細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。