王少熙, 陰 玥, 胡晨霞

(1.西北工業(yè)大學(xué) 微電子學(xué)院,陜西 西安 710072；2.西北工業(yè)大學(xué)深圳研究院,廣東 深圳 518057；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州 510006)

0 引 言

目前,BCSCs研究已成為腫瘤研究領(lǐng)域熱點(diǎn)，然而對(duì)腫瘤干細(xì)胞生長(zhǎng)或分化的微環(huán)境研究卻鮮有相關(guān)資料，現(xiàn)有研究多集中于生理學(xué)方面微環(huán)境模擬，研究方法多具有低通量，較差空間和時(shí)間控制性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較差等缺陷[1～4]。不同的微環(huán)境機(jī)械因素如剪切力或基底硬度不同、不同生化信號(hào)刺激如細(xì)胞與細(xì)胞之間旁分泌及細(xì)胞自分泌類型和細(xì)胞所處空間結(jié)構(gòu)的不同、傳統(tǒng)二維培養(yǎng)與腫瘤干細(xì)胞真實(shí)體內(nèi)三維環(huán)境不同，都將對(duì)腫瘤干細(xì)胞的富集培養(yǎng)和分化產(chǎn)生不同影響；此外傳統(tǒng)方法所需過多的試劑耗材和細(xì)胞量限制了同時(shí)對(duì)多種腫瘤干細(xì)胞的研究及大批量藥物篩選。因此,受材料、空間、時(shí)間等因素的限制，傳統(tǒng)處理細(xì)胞的方法難以滿足腫瘤干細(xì)胞研究的需要[5]。

微流控芯片(microfluidic chip)或稱為芯片實(shí)驗(yàn)室(Lab on chip)，是把化學(xué)和生物等領(lǐng)域中所涉及的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測(cè)等基本操作單元集成到一塊幾平方厘米(甚至更小)的芯片上，由微通道形成網(wǎng)絡(luò)，以可控流體貫穿整個(gè)系統(tǒng)，用以取代常規(guī)化學(xué)或生物實(shí)驗(yàn)室的各種功能的一種技術(shù)平臺(tái)[6]。2004年,美國(guó)Business 2.0雜志在封面文章中把其列為“改變未來的七種技術(shù)之一” 。2006年7月,《Nature》雜志發(fā)表了一期題為“芯片實(shí)驗(yàn)室”的專輯，從不同角度闡述了芯片實(shí)驗(yàn)室的研究歷史、現(xiàn)狀和應(yīng)用前景，并認(rèn)為，芯片實(shí)驗(yàn)室可能成為“這一世紀(jì)的技術(shù)”[7]。由于微通道的尺寸與細(xì)胞尺寸相當(dāng)，可以通過微流控芯片對(duì)細(xì)胞的研究深入到單細(xì)胞甚至亞細(xì)胞器水平，比傳統(tǒng)的對(duì)整群細(xì)胞進(jìn)行分析的手段更加準(zhǔn)確，對(duì)研究細(xì)胞內(nèi)分子相互作用有極其重要的意義。與傳統(tǒng)試驗(yàn)方法比較，微流控芯片具有分析速度快、高通量、成本低以及精度高等特點(diǎn)；芯片制作材料多為二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)，具有可塑性好、透明便于觀察、透氣性好卻不漏水、良好生物兼容性、無毒、不導(dǎo)電以及具有極佳的熱穩(wěn)定性和化學(xué)惰性特點(diǎn)[9]。針對(duì)干細(xì)胞微環(huán)境因素，采用微流控芯片具有如下明顯優(yōu)勢(shì)：1)微流控芯片可進(jìn)行三維培養(yǎng)和干細(xì)胞微環(huán)境模擬及調(diào)控。微流控芯片可構(gòu)建出與細(xì)胞尺度匹配的三維空間,并調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)所需的時(shí)間長(zhǎng)短；能夠模擬體內(nèi)腫瘤干細(xì)胞三維狀態(tài)下的生長(zhǎng)狀況及與微環(huán)境中其他細(xì)胞相互作用，實(shí)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞微環(huán)境的三維培養(yǎng)，三維培養(yǎng)狀態(tài)下的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，能夠真實(shí)地反映腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特征，為微流控芯片技術(shù)在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究方面提供了一個(gè)新思路。2)微流控芯片能構(gòu)建腫瘤干細(xì)胞微環(huán)境中的基質(zhì)材料硬度、密度、空隙率等，更為真實(shí)地反映腫瘤干細(xì)胞與物理微環(huán)境的相互作用。3)微流控芯片將生化因素整合入三維細(xì)胞微環(huán)境中；模擬微環(huán)境中的細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等對(duì)腫瘤干細(xì)胞的影響，以及能制造濃度梯度、轉(zhuǎn)移模型、細(xì)胞分離及遷移、藥物的開發(fā)及新的治療方式探索[9,10]。

綜上分析，采用微流控芯片富集培養(yǎng)BCSCs微球體模型，研究微流控芯片體外模擬和調(diào)控BCSCs培養(yǎng)的最佳微環(huán)境；設(shè)計(jì)不同的微流控芯片平臺(tái)，研究抗腫瘤化合物對(duì)BCSCs的抗腫瘤效應(yīng)及作用機(jī)制；應(yīng)用微流控芯片高通量、低成本篩選靶向殺傷BCSCs藥物研究等對(duì)提高乳腺癌治療效果具有重要意義。

1 芯片設(shè)計(jì)

1.1 芯片設(shè)計(jì)

乳腺癌腫瘤干細(xì)胞微流控培養(yǎng)的核心是實(shí)現(xiàn)芯片內(nèi)懸浮三維培養(yǎng)。本項(xiàng)目采用多層結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，頂層和底層包含微通道，中間層為細(xì)胞懸浮陣列，構(gòu)建形成單細(xì)胞捕獲結(jié)構(gòu)陣列。中間層細(xì)胞懸浮陣列的每個(gè)位置對(duì)應(yīng)頂層一個(gè)單細(xì)胞捕獲結(jié)構(gòu)，當(dāng)細(xì)胞遇到捕獲結(jié)構(gòu)，則會(huì)在壓力場(chǎng)作用下緩慢落入懸浮捕獲陣列中，而陣列的每個(gè)懸浮位置只能容納單細(xì)胞，由此構(gòu)建成單細(xì)胞懸浮陣列，單細(xì)胞懸浮陣列形成芯片的BCSCs培養(yǎng)腔。芯片結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 微流控芯片結(jié)構(gòu)示意

圖1中，A、B和C為輸入輸出連接口，D為閥。載有乳腺癌腫瘤干細(xì)胞的培養(yǎng)液從Layer1的A口注入，同時(shí)關(guān)閉D閥，當(dāng)腫瘤干細(xì)胞被Layer 2的腔體陣列捕獲后，關(guān)閉A 注入口以及打開D 閥。其中,Layer 2的單個(gè)腔體陣列直徑為300 μm，高度為100 μm。然后細(xì)胞培養(yǎng)液可以從B 端口注入。Layer 1和Layer 3由通道組成，通道的尺寸為50 μm高，寬度為100～200 μm，具體形狀根據(jù)不同的部位改變。其中D閥處高度為10 μm。端口C為廢液出口。

1.2 芯片仿真

培養(yǎng)液注入的速度影響腫瘤干細(xì)胞的存活率，關(guān)鍵的參數(shù)是溶液對(duì)干細(xì)胞的剪切力。文獻(xiàn)[11]提出細(xì)胞富集存活受到的剪切力最大不能超過50 μN(yùn)/cm2，本文采用培養(yǎng)液低速注入方式，仿真結(jié)果如圖2所示。

圖2 芯片內(nèi)培養(yǎng)液流速仿真結(jié)果

1.3 芯片制造

根據(jù)芯片結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)模具，利用模具進(jìn)行芯片制造。PDMS試劑采用美國(guó)道康寧公司的Sylgard 184，按照10︰1比例配置硅膠組分和固化劑，置入真空泵去泡15 min，然后灌膠到SU8模具上放置90 ℃烘膠臺(tái)2 h。等PDMS層凝固后冷卻并剝離，得到PDMS單層芯片。原理和步驟雷同可以得到所需要的3層芯片。最后采用表面真空等離子氧化處理進(jìn)行層與層對(duì)準(zhǔn)鍵合，得出最終的芯片樣品，如圖3所示。

圖3 芯片最終樣品示意(尺寸為3 cm×5 cm)

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

首先進(jìn)行人乳腺癌細(xì)胞系MCF—7及 MDA—MB—231腫瘤干細(xì)胞微球體的預(yù)培養(yǎng)，MCF—7細(xì)胞在無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基，即含體積分?jǐn)?shù)1 %雙抗,2 %B27,20 ng/mL EGF和20 ng/mL bFGF的DMEM/F—12培養(yǎng)液(SFM)中培養(yǎng)過程中有部分細(xì)胞呈貼壁分化的狀態(tài)，培養(yǎng)48h后，懸浮細(xì)胞逐漸形成較小的初始懸浮細(xì)胞團(tuán)。在倒置顯微鏡下可見初始懸浮細(xì)胞團(tuán)由幾個(gè)至十幾個(gè)正在分裂的新生細(xì)胞組成懸浮球，逐漸增大，且數(shù)量明顯增多，呈類圓形，折光性增強(qiáng)，形態(tài)大小各異。第5天開始就可觀察到典型的MCF—7腫瘤干細(xì)胞懸浮細(xì)胞球的出現(xiàn)。且細(xì)胞球經(jīng)0.05 %胰蛋白酶消化為單細(xì)胞懸液后，仍能在SFM中生存并傳代形成第2代腫瘤干細(xì)胞球，1 w傳代一次，直至16代仍能繼續(xù)生長(zhǎng)增殖形成腫瘤球，成功建立MCF—7腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)法。懸浮球應(yīng)用含F(xiàn)BS培養(yǎng)基分化培養(yǎng)后，仍能貼壁增殖，但細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，由原來的上皮細(xì)胞鋪路石樣形態(tài)轉(zhuǎn)為成纖維細(xì)胞樣形態(tài)。MDA—MB—231懸浮球細(xì)胞聚集相對(duì)松散，目前正在完善懸浮球培養(yǎng)條件(如圖4所示)。

圖4 MCF—7及 MDA—MB—231貼壁細(xì)胞及腫瘤干細(xì)胞球形態(tài)

將預(yù)培養(yǎng)的腫瘤干細(xì)胞球形態(tài)連同培養(yǎng)基注入上述所描述的芯片內(nèi)，進(jìn)行連續(xù)觀察富集，結(jié)果如圖5所示。

圖5 乳腺癌腫瘤干細(xì)胞片內(nèi)培育示意

圖5所示微流控芯片環(huán)境下乳腺癌腫瘤干細(xì)胞的培養(yǎng)和富集情況，無血清培養(yǎng)基連續(xù)勻速提供，受到培養(yǎng)基動(dòng)態(tài)流動(dòng)的影響，單個(gè)乳腺癌腫瘤干細(xì)胞的位置有變化。在每隔2天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察，結(jié)果如圖5所示。

3 結(jié) 論

采用生物兼容有機(jī)化合物二甲基硅氧烷，設(shè)計(jì)3層結(jié)構(gòu)微流控芯片，包括細(xì)胞及培養(yǎng)液注入層、中間懸浮培養(yǎng)層和廢液處理層。采用真空等離子氧化處理二甲基硅氧烷表面完成對(duì)準(zhǔn)鍵合?；诖宋⒘骺匦酒⑷虢?jīng)預(yù)培養(yǎng)的干細(xì)胞球，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明乳腺癌腫瘤干細(xì)胞在微流控芯片內(nèi)的富集效應(yīng)。