肖穎，商天奕

(信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464000)

半夏 Pinellia temata ( Thunb.) Breit 為天南星科多年生草本植物，具有潤(rùn)燥化痰、降逆止嘔、消腫散結(jié)之功效[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，半夏有抗腫瘤、降血脂和保肝等[2]許多重要的功能。半夏的人工栽培日益擴(kuò)大，但人工栽培的品種(品系)極易受到病毒的侵染，如紫花苜?；ㄈ~病毒、馬鈴薯病毒、大豆花葉病毒、黃瓜花葉病毒和魔芋花葉病毒等廣泛存在于半夏植物中，病毒不斷積累，不僅使病害更為嚴(yán)重，還可傳給后代。當(dāng)前，對(duì)半夏組織培養(yǎng)的研究主要集中在半夏的愈傷組織誘導(dǎo)上[3-5]，對(duì)半夏的解毒技術(shù)研究較少，至今沒(méi)有有效殺滅半夏植株細(xì)胞內(nèi)病毒的方法。因此，幼苗移栽前的預(yù)防就顯得尤為重要。本文將已經(jīng)受侵染的半夏幼苗進(jìn)行多種脫毒處理，獲得大量無(wú)病毒優(yōu)質(zhì)種苗以恢復(fù)半夏種性，提高產(chǎn)量[6]。

1 材料

半夏取自河南省息縣藥材種植地。清洗半夏葉后，將其浸泡在0.1% HgCl2溶液中約10 min，用無(wú)菌水沖洗幾次，并在無(wú)菌條件下切成約1 cm的小塊。消毒后接種到MS+ 6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.1mg/L培養(yǎng)基上，加入蔗糖、瓊脂，pH值調(diào)至5.5～6.5，光照強(qiáng)度調(diào)至2000～3000Lx，光照時(shí)間10～12 h/d，培養(yǎng)溫度25～27℃左右。大約20 d，可以看到葉子變厚，在葉緣切口處發(fā)現(xiàn)新鮮的綠色愈傷組織；大約50d，愈傷組織分化成芽并形成完整的再生植物。

1.1 莖尖大小選擇

選擇再生植株生長(zhǎng)良好的塊莖以獲得幼芽，并通過(guò)用0.1% HgCl2溶液浸泡10 min對(duì)表面進(jìn)行消毒。剝離莖尖的長(zhǎng)度分別為0.2～0.3 mm、0.3～0.4 mm、0.4～0.5 mm、0.5～0.6 mm、0.6～0.7mm、0.7～0.8 mm，每個(gè)處理6瓶，將五個(gè)莖尖接種于組培瓶，培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0mg/L+ NAA0.1mg/L，觀察50d。

1.2 溫度處理選擇

選取生長(zhǎng)良好的組培苗，分別在20、25、30、35、40、45℃進(jìn)行高溫脫毒處理，每次處理6瓶，并將5個(gè)組織培養(yǎng)幼苗接種到組織培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)基為 MS+6-BA1.0 mg/L+ NAA0.1 mg/L，觀察30 d。

1.3 化學(xué)物質(zhì)處理選擇

選取生長(zhǎng)良好的組培苗，在培養(yǎng)基中分別加入三氮唑核苷、堿性孔雀綠、阿糖腺苷、2-硫尿嘧啶、放線菌素 D、病毒唑，對(duì)于6瓶的每次處理，將5個(gè)組織培養(yǎng)幼苗接種到組織培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基為 MS+6-BA1.0 mg/L+ NAA0.1 mg/L.觀察30 d。

2 方法與結(jié)果

2.1 息半夏莖尖大小對(duì)成活率和脫毒效果的影響

將在顯微鏡下剝離的莖尖接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，剝落時(shí)小心不要損壞閥桿尖端。從表1可以看出，莖尖在0.2～0.3 mm，存活率不到一半，但組織培養(yǎng)幼苗生長(zhǎng)良好，葉片均無(wú)斑點(diǎn)，病毒脫除率可達(dá)100.0%；莖尖在0.5～0.8 mm的存活率很高，高達(dá)80.0%。0.7～0.8 mm莖尖成活率甚至高達(dá)90%以上，但葉片大面積出現(xiàn)斑點(diǎn)?？紤]到莖尖成活率與各病毒去除率的關(guān)聯(lián)，最好選擇0.4～0.7 mm的莖尖進(jìn)行脫毒繁育。

表1 莖尖大小對(duì)息半夏組培苗成活率和脫毒效果的影響

2.2 高溫處理對(duì)息半夏成活率和脫毒效果的影響

將栽培的半夏組織培養(yǎng)幼苗置于MS+6-BA1.0 mg/L + NAA0.1 mg/L培養(yǎng)基中。 溫度調(diào)至30～35℃進(jìn)行預(yù)處理，在不同時(shí)間去除經(jīng)高溫處理的幼苗，并在解剖顯微鏡下用帶有1～2個(gè)0.2～0.5 mm的葉原基切割莖尖。誘導(dǎo)成苗，以葉片不帶斑點(diǎn)為脫毒成功。結(jié)果見(jiàn)表2。

在一定范圍內(nèi)，隨著半夏莖尖處理溫度增加，莖尖脫毒效果顯著。然而處理溫度超過(guò)一定范圍后，植株的成活率又出現(xiàn)下降。高溫處理25℃以上時(shí)，脫毒率可明顯提高。處理超過(guò)35℃以上，植株出現(xiàn)大范圍死亡(表2)。因此半夏高溫處理的最佳溫度宜為25～35℃左右。

表2 高溫處理對(duì)息半夏組培苗成活率和脫毒效果的影響

2.3 化學(xué)物質(zhì)對(duì)息半夏試管苗侵染病毒的控制效果

向培養(yǎng)基中加入不同的化學(xué)物質(zhì)，將無(wú)菌幼苗傳代培養(yǎng)并轉(zhuǎn)移以觀察其生長(zhǎng)情況。從表3可以看出，表中各種化學(xué)物質(zhì)對(duì)幾種被污染的病毒都具有一定的抑制作用，其中以三氮唑核苷效果最好。從生長(zhǎng)情況看,堿性孔雀綠會(huì)造成生長(zhǎng)受到抑制；阿糖腺苷易造成玻璃化。綜合考慮抑菌效果和對(duì)生長(zhǎng)的影響,以三氮唑核苷或放線菌素D效果較好，既可有效抑制息半夏組培苗污染的常見(jiàn)病毒，又不影響組培苗的生長(zhǎng)。

表3 化學(xué)物質(zhì)對(duì)息半夏組培污染菌的抑制效果

2.4 半夏脫毒苗的移栽

2.4.1 實(shí)驗(yàn)室移栽 當(dāng)脫毒苗長(zhǎng)到5cm左右時(shí)進(jìn)行移栽，先打開(kāi)瓶蓋煉苗2～3d，多次沖洗脫毒苗根部直至培養(yǎng)基完全去除，移植到托盤(pán)中，并定期加入移植液，成活率高達(dá)80%以上。試驗(yàn)表明：定植適合于春秋兩季，植物成活率明顯提高；夏季由于高溫高濕，容易造成污染，植物的成活率顯著降低；冬季溫度降低，植株生長(zhǎng)緩慢。

2.4.2 防蟲(chóng)網(wǎng)棚保護(hù)移栽 將實(shí)驗(yàn)室練好的脫毒苗進(jìn)入大棚栽培，用土蓋實(shí)根部，用多菌靈800倍液水澆透，再用拱棚覆蓋保持一定的溫、濕度，可得到較高移栽成活率，縮短了脫毒技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)程。

3 分析與討論

在生長(zhǎng)過(guò)程中，半夏對(duì)病毒非常敏感，嚴(yán)重影響了半夏的大范圍栽植。采取高溫結(jié)合剝離莖尖脫毒的方法，再輔以抗生素的使用，可使去除病毒成功率高達(dá)85%以上。植物在高溫條件生長(zhǎng)加快，以頂端分生組織分裂為盛，而高溫條件下病毒的活性受到抑制，抗生素的加入將進(jìn)一步加強(qiáng)抑制，因此極大地增加了獲得脫病毒植株的成功率。由于使用抗生素存在一定的不確定性，芽尖培養(yǎng)物通常與生產(chǎn)中的熱處理相結(jié)合。熱處理技術(shù)的主要原理是病毒加熱后不穩(wěn)定，活性鈍化，生殖能力降低，傳染性喪失，而植物細(xì)胞分裂加速，不受高溫影響。 Bhardwaj等[7]發(fā)現(xiàn)用熱空氣法脫除蘋(píng)果花葉病病毒，解紅娥等[8]聯(lián)合熱處理與莖尖培養(yǎng)解毒法對(duì)半夏管苗進(jìn)行解毒，再進(jìn)行高溫預(yù)處理，然后選擇適當(dāng)大小的莖尖進(jìn)行培養(yǎng)，這種方法大大提高了解毒率和成活率。許多化學(xué)物質(zhì)可以不同程度地抑制病毒的復(fù)制，但很難找到干擾病毒復(fù)制而不影響宿主細(xì)胞正常代謝的藥物，并且在實(shí)際生產(chǎn)中較少使用。

半夏脫毒后的無(wú)病毒苗沒(méi)有外加的抗病性，如果保存不當(dāng)可以再次染上，若用合適的方法保存可以利用 5～8年。在夏季將解毒苗移栽，并且用300目昆蟲(chóng)網(wǎng)以防止螨蟲(chóng)進(jìn)入；土壤施用高錳酸鉀溶液消毒，周邊環(huán)境保持整潔；同時(shí)噴施農(nóng)藥防治蟲(chóng)害。這種方法可以極大地縮短脫毒技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)程，且移栽成活率也得以提升。