吳井生 陳永霞

摘要：為研究稀釋液配方和稀釋倍數(shù)對豬精子活力及運動參數(shù)的影響，篩選了5個稀釋液配方，設計了6個稀釋倍數(shù)，采用CASA系統(tǒng)檢測精子活力、活動率、運動速度及運動方式等參數(shù)指標，利用SPSS 19.0軟件中GLM程序進行分析表明，5個配方精子活力（PR）或精子活動率（PR+NP）中，F(xiàn)2最高，F(xiàn)3次之，但兩者間差異不顯著，與其他3個配方比較差異極顯著;精子速度方面，同樣以F2最快，仍與F3差異不顯著，與其他配方差異顯著或極顯著;精子運動形式參數(shù)方面，WOB指標中，5個配方間差異均不顯著;其他指標，F(xiàn)2和F3較高。稀釋倍數(shù)上，就PR、PR+NP而言，兩者均隨稀釋倍數(shù)的增大而表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。因此，稀釋液配方中，經(jīng)典的豬稀釋液配方為最優(yōu)，確定配方為：葡萄糖5.0 g、檸檬酸鈉0.3 g、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）;稀釋倍數(shù)PR、PR+NP中，D0.5最優(yōu)，但從經(jīng)濟效益來看，D1為最佳。

關(guān)鍵詞：豬;人工授精;稀釋液配方;稀釋倍數(shù);精子活力;CASA

隨著豬人工授精技術(shù)廣泛應用，生產(chǎn)中對豬精液的要求也越來越高。豬的副性腺發(fā)達，因此豬精液中副性腺分泌物濃度高，射精量大，可達200～300 mL，密度（1～2）×109個/mL。研究表明，豬精液采集后若不進行任何處理，精子活力會迅速下降，精子死亡率增加，導致母豬受胎率降低;在保證精子活力、有效精子數(shù)等前提下，對豬精液進行適當?shù)南♂?，一方面可以增加精液量，提高受配母豬頭數(shù)，另一方面可以沖淡精液中副性腺分泌物，鞏固原生質(zhì)膜，并供給充分的營養(yǎng)物質(zhì)，防止細菌孳生，延長精子保存時間。因此，在人工授精前對精液進行適當處理可以提高公豬的種用價值，保證母豬群的健康，提高母豬受胎率，增加畜牧生產(chǎn)經(jīng)濟效益[1]。

關(guān)于豬精液稀釋液配方的報道很多，經(jīng)典的稀釋液配方成分主要有：葡萄糖、檸檬酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）;許多研究者從營養(yǎng)物質(zhì)或緩沖物質(zhì)替代物等方面來研究最佳的公豬精液稀釋液配方，常見的替代物有海藻糖[2]、蔗糖[3]、維生素C[4]、甘氨酸[5]等。評價配方優(yōu)劣的主要指標有精子活力、頂體完整性、質(zhì)膜完整性等[6]，但這些指標的評價方法往往缺乏準確性、精確性和實效性。而關(guān)于豬精液稀釋倍數(shù)的報道不多，僅見于對母豬受胎率或產(chǎn)仔數(shù)的影響[8-9]，但并未分析其對精子活力等指標的影響，精子活力檢測是精液品質(zhì)檢查中的一個重要指標，同時精液品質(zhì)檢查是精液采集后、輸精前的一項重要工作。

本試驗從前人研究報道中篩選出5個經(jīng)典稀釋液配方，設計了不同的稀釋倍數(shù)，利用CASA系統(tǒng)對公豬精子活力、活動率和精子運動等參數(shù)指標進行檢測，以期篩選出最佳的稀釋液配方和稀釋倍數(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本試驗的種公豬均來自江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學院種豬場，品種和數(shù)量分別為：長白豬（L）3頭、大白豬（Y）3頭、杜洛克豬（D）4頭、巴克夏豬（B）2頭、梅山豬（M）6頭;均為成年種公豬（28～38月齡）。每頭種公豬采精2次/周，固定采精時間和采精員。試驗時間為2016年11月至2017年7月，試驗地點為江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學院種豬場實驗室。

1.2 精液采集和指標測定

公豬精液的采集用手握法進行;在采精過程中，棄去前、后段精清，收集中段富含精子部分，用4層滅菌紗布過濾精液，采完精后或精液稀釋后，吸取10 μL精液，放入2 μL觀察池（標準計數(shù)板，8個觀察池，池體積22 μL/個，池高 20 μm），置于負相差顯微鏡下觀察、檢測。

采用西班牙CASA系統(tǒng)進行精液質(zhì)量分析，測定的主要精子運動指標如下：

精子活力指標有PR（前向運動精子）、NP（非前向運動精子）;精子運動速度指標有VCL（平均曲線運動速率）、VSL（平均直線運動速率）、VAP（平均路徑速度）;精子運動方式指標有LIN（直線性）、STR（前向性）、WOB（擺動性）、ALH（側(cè)擺幅度）、BCF（鞭打頻率）。

檢測時，要求精子總數(shù)≥500個。

1.3 稀釋液配方和數(shù)據(jù)統(tǒng)計

1.3.1 配制稀釋液 本試驗中共采用5個配方，分別標記為F1、F2、F3、F4、F5，每個配方體系為100 mL;配方中藥品，均購自Sigma公司，采用分析天平準確稱取;藥品稱取后，加入ddH2O在磁力攪拌器下充分溶解;用100 mL容量瓶定容后，放入事先高壓滅菌的玻璃瓶中，貼上標簽，4 ℃保存3 d;稀釋液使用前，升溫至37 ℃，加入青霉素和鏈霉素，具體配方見表1。

采集所得精液室溫下放置1～2 h，用所配稀釋液按1 ∶ 1比例進行稀釋，稀釋后靜置2 min，后置于顯微鏡下觀察檢測。

1.3.2 稀釋倍數(shù)的確定 取0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0份稀釋液，稀釋液配方采用表1中的F2，分別加入1份精液中，組成稀釋倍數(shù)分別記為D0、D0.5、D1、D2、D3和D4;取1份稀釋液，配方采用表1中的F3，加入1份精液中，組成稀釋倍數(shù)記為D5。

1.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 應用SPSS 19.0軟件中GLM程序?qū)Ω黜棓?shù)據(jù)進行方差分析，差異顯著或極顯著時采用LSD法或Tamhanes T2法進行多重比較，結(jié)果用“最小二乘均數(shù)±標準差（x±s）”表示，其線性模型如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 稀釋液配方對精子活力或活動率的影響

不同稀釋液配方下精子活力或活動率的結(jié)果見表2。由表2可知，PR方面，F(xiàn)2的PR水平最高，為0.107 3±0.133 8，其次為F3，兩者間差異不顯著（P>0.05），但與F5、F1、F4間差異極顯著（P<0.01）;5個配方PR水平的總體趨勢為：F2>F3>F5>F1>F4。PR+NP方面，F(xiàn)2的水平最高，F(xiàn)2、F3間差異不顯著（P>0.05），F(xiàn)5和F1間差異不顯著（P>0.05），F(xiàn)4的 PR+NP水平最低，與其他各組間差異均極顯著（P<0.01）。

2.2 稀釋液配方對精子運動速度參數(shù)的影響

不同稀釋液配方下精子運動速度參數(shù)結(jié)果見表3。由表3可知，就VCL而言，F(xiàn)2的速度最快，為（27.37±9.03） μm/s，其次是F3，兩者間差異不顯著;F4的速度最慢，僅為（18.61±4.03） μm/s，與其他各組相比，差異極顯著（P<0.01）;就VSL而言，F(xiàn)2的速度最快，為（6.89±2.99） μm/s，大小順序為：F2>F3>F5>F1>F4，F(xiàn)1和F4分別與其他各組相比，差異均達到極顯著水平;就VAP而言，F(xiàn)2的速度最快，其次是F3，并與F5、F1或F4相比，差異顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）。

2.3 稀釋液配方對精子運動方式參數(shù)的影響

不同稀釋液配方下精子運動方式參數(shù)結(jié)果見表4。由表4可知，LIN方面，F(xiàn)2最高，為（24.66±5.59）%，其次為F3和F5，三者間差異均不顯著（P>0.05），與F1和F4間差異顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）;STR方面，F(xiàn)3最高，與F2和F5相比，差異均不顯著（P>0.05），與F4和F1相比，差異顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）;WOB方面，5個配種組合間差異均不顯著（P>0.05）。就ALH而言，F(xiàn)3的最大，為（2.28±0.59） μm，與F2和F5均差異不顯著（P>0.05），F(xiàn)1、F2和F5三者間差異也都不顯著（P>0.05）;就BCF而言，F(xiàn)2和 F3一樣快，均為 4.17 Hz，與其他各組間差異顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）。

2.4 稀釋倍數(shù)對精子活力或活動率和運動參數(shù)的影響

不同稀釋倍數(shù)下精子活力（PR）和運動速度參數(shù)結(jié)果見表5。由表5可知，就PR而言，D0～D4間，D0.5最高，為 0.348 3±0.196 5;以D0為對照組，與D0.5差異顯著（P<0.05），與D1差異不顯著（P>0.05），與D2～D4差異極顯著（P<0.01）;D1和D5差異不顯著（P>0.05）。就PR+NP而言，D0～D4間，D0.5最高，為0.772 7±0.237 2;以D0為對照組，與D0.5、D1差異不顯著（P>0.05），與D2、D3間差異極顯著（P<0.01），D1和D5比較，差異不顯著（P>0.05）。VCL方面，D0～D4間，D0.5最大，為（46.37±20.51） μm/s，與D0相比，D0.5差異極顯著（P<0.01），與D1～D3差異不顯著（P>0.05），與D4差異極顯著（P<0.01）;D1和D5比較，差異顯著（P<0.05）。VSL方面，D0～D4間，D0.5最大，為（14.38±6.35） μm/s;D0與D0.5差異極顯著（P<0.01），與D1差異顯著（P<0.05），與D2～D4差異不顯著（P>0.05）;D1和D5比較，差異不顯著（P>0.05）。VAP方面，D0～D4間，D0.5最大，為（26.06±11.08） μm/s;D0與D0.5差異極顯著（P<0.01），與D1～D3間差異不顯著（P>0.05），與D4差異極顯著（P<0.01），D1和D5間差異不顯著（P>0.05）。

2.5 稀釋倍數(shù)對精子運動方式的影響

不同稀釋倍數(shù)下精子運動方式參數(shù)結(jié)果見表6。由表6可知，LIN方面，D0～D4中，D4最高，為33.90%±12.70%;以D0為對照組，與D0.5～D3差異不顯著（P>0.05），與D4差異極顯著（P<0.01）;D1和D5間差異不顯著（P>0.05）。STR方面，D0～D4中，D4最高，為58.12%±12.36%;以D0為對照組，與D0.5和D1差異不顯著（P>0.05），與D2和D3差異顯著（P<0.05），與D4差異極顯著（P<0.01）;D1和D5間差異不顯著（P>0.05）。WOB方面，D0～D4中，D1最高，為 （56.64±7.76）%;D0與D0.5～D4間差異均不顯著（P>0.05）;D1和D5間差異不顯著（P>0.05）。就ALH而言，D0～D4中，D0.5最高，為（2.81±0.70） μm;D0與D0.5和D1差異不顯著（P>0.05），與D2～D4差異極顯著（P<0.01）;D1和D5間差異不顯著（P>0.05）。就BCF而言，D0～D4中，D2最快，為（5.23±1.49） Hz;D0與D0.5～D2間差異極顯著（P<0.01），與D3差異不顯著（P>0.05），與D4差異顯著（P<0.05）;D1和D5間差異不顯著（P>0.05）。

3 討論

關(guān)于豬精液稀釋液配方的報道很多，馬紅等用本試驗中的F4作為冷凍基礎液或稀釋液研究了民豬精液冷凍技術(shù)[7]。程明等研究4種稀釋液對不同品種公豬精子活力的影響，結(jié)果顯示，用葡-檸-乙液（本試驗中的F2）稀釋的精液在保存后20 h和32 h觀察到的精子活力平均數(shù)要顯著高于葡萄糖液、葡-檸液和自制多成分稀釋液，因此認為葡-檸-乙液比其他稀釋液更適合豬精的稀釋[10]。王占赫等研究了不同稀釋液對公豬精液保存效果的影響，所用11個稀釋液配方必選藥品有葡萄糖和檸檬酸鈉，其他藥品有EDTA、碳酸氫鈉和KCl，結(jié)果顯示，1號和2號稀釋液的精子有效存活時間和精子存活總時間是最優(yōu)的，兩者間差異不顯著，1號稀釋液配方為：葡萄糖3.72 g、檸檬酸鈉0.60 g、EDTA 0.12 g、碳酸氫鈉 0.12 g、KCL 0.08 g，2號稀釋液配方為：葡萄糖2.4 g、檸檬酸鈉1.0 g、EDTA 0.1 g、碳酸氫鈉0.1 g，2個配方的體系均為100 mL[11]。陳曉暢等研究了關(guān)中黑豬精液常溫保存情況，結(jié)果顯示不同稀釋液中，保存效果最好的是Ⅲ號稀釋液，可保存5 d，活力為0.5，短時間內(nèi)（≤2 d），Ⅰ號和Ⅲ號保存效果無明顯差異;而Ⅰ號稀釋液成本更低，更適合生產(chǎn)實踐中的應用;Ⅲ號稀釋液配方為：葡萄糖27.50 g、檸檬酸鈉6.90 g、EDTA 2.35 g、碳酸氫鈉1.00 g、檸檬酸2.90 g、Tris 5.65 g，Ⅰ號稀釋液配方為：葡萄糖37.00 g、檸檬酸鈉6.00 g、EDTA 1.25 g、碳酸氫鈉1.25 g、Tris 0.75 g，2個配方的體系均為1 L[12]。許多研究報道中豬精液稀釋液配方中主要藥品有：葡萄糖、檸檬酸鈉、EDTA-2Na[2]，在此基礎加入其他藥品，諸如谷氨酰胺（Gln）[6]、羧甲基纖維素鈉（CMC）[13]、海藻糖[2]、黃芪多糖[14]、精漿[15]、維生素C[4]、紅景天多糖[5]、蔗糖[3]、甘氨酸[5]等，以期篩選出最佳的精液稀釋液配方。本試驗5個配方中，就精子活力（PR）或精子活動率（PR+NP）而言，F(xiàn)2的最高，其次是F3，但兩者間差異不顯著，與其他3個配方比較差異極顯著;精子速度方面，也是以F2最快，與F3差異不顯著，與其他配方差異顯著或極顯著;精子運動形式參數(shù)方面，就WOB指標而言，5個配方間差異不顯著，其他指標以F2和F3為高。

關(guān)于豬精液稀釋倍數(shù)的報道不多，沈培敏研究了豬精液不同倍數(shù)稀釋授精效果，結(jié)果顯示，稀釋6倍時，受胎率最高，為92%，窩均產(chǎn)仔數(shù)最多，為11頭，隨后為稀釋倍數(shù)2、4、8、10倍，認為精液稀釋倍數(shù)小，精子密度大，供給精子貯存過程中的養(yǎng)分偏少，而稀釋倍數(shù)過大，則有效精子會降低，而且活力也會降低，影響母豬繁殖性能[8]。李鼎祿等研究豬精液稀釋倍數(shù)對受胎率窩產(chǎn)仔數(shù)的影響，采用的稀釋液為葡-檸-乙液（本試驗中的F2，配方略有不同，葡萄糖 5.55 g、檸檬酸鈉0.50 g、EDTA-2Na 0.10 g），分別稀釋3、5、8倍，結(jié)果顯示，采用的各品種公豬精液進行8倍稀釋時，與常規(guī)的3倍稀釋間，對情期受胎率、窩產(chǎn)仔數(shù)無影響[9]。關(guān)于精液稀釋倍數(shù)在羊[16-17]和雞[18-19]上也有報道。在南江黃羊上，郭洪杞認為精液有效存活時間、第1情期受胎率以稀釋倍數(shù)15倍較高，分別為50 h、80%[16]。徐相亭等研究顯示，精液稀釋3、4、5倍解凍后精子活率分別為0.502、0.501、0.495（P>0.05），均高于稀釋6、7、8倍的精子活率（P<0.01），表明波爾山羊冷凍精液稀釋倍數(shù)以3～5倍為宜[17]。張曉華等研究了雞精液稀釋的影響因素，結(jié)果顯示雞精液在先冷藏后等溫稀釋，高倍稀釋的雞精子活力顯著低于低倍稀釋，而先等溫稀釋后冷藏，高倍和低倍稀釋的雞精子活力差異不顯著[18]。本試驗中，就PR和PR+NP而言，兩者均隨稀釋倍數(shù)的增大而表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，D0.5最大，這種現(xiàn)象在其他動物均未有所報道，其中原因值得探究;從不同稀釋液相同稀釋倍數(shù)條件下的結(jié)果來看，兩者差異不顯著，說明所選2個稀釋液配方對精子的影響相當。

4 結(jié)論

本試驗中，就稀釋液配方而言，以經(jīng)典的豬精液稀釋液配方為最優(yōu)，配方如下：葡萄糖5.0 g、檸檬酸鈉0.3 g、EDTA-2Na;就稀釋倍數(shù)而言，從PR和PR+NP方面，D0.5最優(yōu)，但從經(jīng)濟效益來看，D1是最佳的。

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