趙海霞 裴紅賓 張永清

摘要：通過盆栽試驗(yàn)研究2種肥料（氮肥和腐殖酸肥）不同施用量與芽孢桿菌ZJM-P5菌懸液組合處理對(duì)紅小豆幼苗根際土壤酶活性的影響，為紅小豆經(jīng)濟(jì)合理施肥和微生物肥料菌種選育提供理論依據(jù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，（1）同一施肥水平下，2種栽培環(huán)境下的土壤脲酶、蔗糖酶和過氧化氫酶活性均隨菌懸液濃度的增大呈先升高后降低的趨勢，其中脲酶活性均在107 CFU/mL濃度下達(dá)最大值，蔗糖酶活性除0、50 mg/kg施氮處理外其他施肥水平均在107 CFU/mL濃度下達(dá)最大值，而過氧化氫酶活性均在108 CFU/mL時(shí)最大。（2）相同菌懸液濃度下，與不施肥處理相比，施氮、腐殖酸肥處理的脲酶活性均隨施肥量的增加呈升高趨勢;施氮處理的蔗糖酶活性在0、106 CFU/mL濃度下隨施氮量的增加而增大，在108 CFU/mL和109 CFU/mL下不同施氮處理的酶活性接近，107 CFU/mL濃度下在100 mg/kg施氮處理時(shí)酶活性顯著高于其他處理，而過氧化氫酶活性隨施氮量的增加先增大后減小，在100 mg/kg時(shí)酶活性最大;腐殖酸肥處理的蔗糖酶活性隨施肥量的增加呈先升后降的趨勢，在0.67 g/kg處理下酶活性最大，而過氧化氫酶活性隨施肥量的增加逐漸增大。（3）相同菌懸液濃度下2種栽培環(huán)境間土壤酶活性結(jié)果比較得出，施用腐殖酸效果優(yōu)于化學(xué)氮肥。研究結(jié)果表明，對(duì)于種植紅小豆來說，芽孢桿菌ZJM-P5菌懸液濃度為107～108 CFU/mL為最佳菌濃度，純氮量為100 mg/kg、腐殖酸量0.67 g/kg為最佳施肥量，合理濃度的菌懸液和肥料組合處理可以更大作用地發(fā)揮土壤酶的生物學(xué)活性。

關(guān)鍵詞：紅小豆;施肥;芽孢桿菌ZJM-P5菌懸液;土壤酶活性

土壤作為植物的生長載體，其肥力與作物產(chǎn)量及品質(zhì)密切相關(guān)，而土壤酶作為土壤生物活性和肥力的重要組成部分，在土壤物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)化過程中起著重要的催化作用，其活性可以反映土壤中各種生物化學(xué)反應(yīng)的強(qiáng)度和方向[1]，對(duì)土壤肥力的演化具有重要影響[2]。目前人們已從不同種植方式[3-4]、不同肥料及施用方式[5-6]、不同微生物處理[7-8]以及不同逆境[9]等方面對(duì)土壤酶活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)這些條件均對(duì)土壤酶活性具有一定影響，且和土壤肥力以及作物產(chǎn)量和品質(zhì)具有一定相關(guān)性。因此，土壤蔗糖酶、脲酶和過氧化氫酶等酶活性可作為土壤肥力和土壤質(zhì)量生物活性評(píng)價(jià)的潛在指標(biāo)[10]，對(duì)土壤肥力培育和合理施肥具有一定意義。

芽孢桿菌（Bacillus）因其具有抗逆性強(qiáng)、生長快速、適應(yīng)范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，已在多個(gè)領(lǐng)域中被研究和應(yīng)用，應(yīng)用前景良好[11-12]。目前，已有研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌在植物促生、根際微生態(tài)改良、土壤酶活性調(diào)節(jié)、土壤肥力提升和提高養(yǎng)分利用率等方面具有重要意義[13-14]，如劉麗等研究表明接種微生物菌劑均可不同程度地提高土壤酶活性[8];張美存等研究發(fā)現(xiàn)接種微生物菌劑使土壤酶活性提高，改善了根際微生態(tài)環(huán)境，提高了土壤肥力和養(yǎng)分利用率[15]。雖然目前已有研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌對(duì)土壤酶活性具有一定的調(diào)節(jié)作用，但是在生產(chǎn)實(shí)踐中單純依靠微生物菌劑還無法滿足作物需求，依然需要化肥投入。因此，本研究以芽孢桿菌和肥料組合為處理，綜合分析在二者作用下對(duì)土壤酶活性的影響。

腐殖酸作為動(dòng)植物殘?bào)w經(jīng)過微生物分解和轉(zhuǎn)化以及地球化學(xué)的一系列過程形成和積累起來的一類有機(jī)物質(zhì)[16]，在促進(jìn)植物生長、土壤結(jié)構(gòu)改良以及肥料增效等方面具有重要作用[17]，是有效緩解化肥過量施用負(fù)面問題和減少化肥用量的途徑之一。如劉蘭蘭等研究腐殖酸肥料對(duì)生姜土壤微生物量和酶活性的影響，表明施用腐殖酸可增加土壤活躍微生物量，使土壤酶活性得到調(diào)節(jié)[18]。但有關(guān)腐殖酸和外源芽孢桿菌雙重作用下對(duì)土壤酶活性的影響還鮮有報(bào)道。

紅小豆（Phaseolus angularis L.）為豆科豇豆屬一年生草本植物，除富含多種生物活性物質(zhì)，是一種高蛋白、低脂肪、多營養(yǎng)的功能食品外[19]，還具有土壤適應(yīng)性強(qiáng)和固氮養(yǎng)地等作用，也是我國出口創(chuàng)匯的重要雜糧作物[20]。目前人們已從水氮耦合[21]、低磷脅迫[22]和NaCl脅迫[23]、不同播期[24]以及氮、磷、鉀肥配施[25]等方面對(duì)其高效栽培技術(shù)進(jìn)行了相關(guān)研究，而有關(guān)不同氮肥和腐殖酸用量下促生芽孢桿菌對(duì)其根際土壤酶活性的影響還未見相關(guān)報(bào)道。因此本研究以筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期篩選到的紅小豆促生芽孢桿菌ZJM-P5（107 CFU/mL 時(shí)可有效提高紅小豆幼苗品質(zhì)并促進(jìn)其養(yǎng)分吸收[26]）為研究對(duì)象，對(duì)其在氮肥和腐殖酸分別聯(lián)合作用下紅小豆根際土壤酶活性進(jìn)行對(duì)比分析，旨在明確芽孢桿菌ZJM-P5在氮肥和腐殖酸2種栽培環(huán)境下對(duì)紅小豆幼苗根際土壤酶活性的影響，探討腐殖酸在紅小豆栽培中的應(yīng)用潛力，尋求合理、科學(xué)的施肥方式，為芽孢桿菌ZJM-P5生物菌肥的開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)，為促生芽孢桿菌和腐殖酸聯(lián)合應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)，也為紅小豆高效栽培體系、“減肥”目標(biāo)實(shí)現(xiàn)以及種植產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試植物為晉紅小豆5號(hào)，由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供。供試菌株為芽孢桿菌ZJM-P5，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室從酸棗植株內(nèi)篩選、分離、保存。供試土壤取自石灰性褐土下層，養(yǎng)分含量較低，其理化性質(zhì)為全氮含量30 mg/kg，速效磷含量 2.8 mg/kg，速效鉀含量92.32 mg/kg，風(fēng)干后備用。供試肥料為分析純試劑尿素（含N 46%）、過磷酸鈣（含P2O5 15%）和氯化鉀（含K2O 52%）;腐殖酸山西臨汾生產(chǎn)的風(fēng)化煤，風(fēng)化煤含水量為20.41%，腐殖酸總量為40.10%，游離腐殖酸含量為38.15%，pH值為3.91。采用盆栽，用上口徑18 cm、下口徑16 cm、高18 cm的培養(yǎng)缽，可裝風(fēng)干土2 kg。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)于2016年5月初開始在山西師范大學(xué)農(nóng)場防雨棚進(jìn)行。試驗(yàn)采用2因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，芽孢桿菌ZJM-P5濃度設(shè)5個(gè)梯度：0、106、107、108、109 CFU/mL，分別用B1、B2、B3、B4、B5表示。肥料包括氮肥和腐殖酸肥2種，各設(shè)4個(gè)水平，氮為N1、N2、N3、N4，腐殖酸為H1、H2、H3、H4，具體施用量見表1，每種肥料共20（5×4）個(gè)處理組合，每個(gè)處理3次重復(fù)，共種60盆。另1 kg土分別施0.2 g P2O5和0.3 g K2O作為肥底，所有肥料均作為底肥與土壤混合均勻后一次性施入。試驗(yàn)時(shí)，選取飽滿均勻且無病害的種子，用3% H2O2浸泡 30 min 作表面消毒，蒸餾水沖洗后浸泡7 h，于2016年5月10日播種，每盆播15粒種子，待第1對(duì)單葉完全展開后每盆定苗7株，3葉期（5月25日）時(shí)用200 mL不同濃度的菌懸液灌根處理。

1.3 測定項(xiàng)目與方法

1.3.1 土樣的采集 從灌根當(dāng)天至生長30 d時(shí)開始收集土壤，把培養(yǎng)缽撕開，將幼苗連同根系土壤從培養(yǎng)缽中取出，輕輕抖落根系外圍土壤后，用軟毛刷收集松散黏附在根系表面的土壤作為根際土壤，然后將每個(gè)處理（3盆）所取根際土壤混合均勻，裝入塑封袋內(nèi)立刻帶回實(shí)驗(yàn)室對(duì)其進(jìn)行除雜，風(fēng)干后過1 mm篩用于土壤酶活性的測定。

1.3.2 土樣酶活性的測定 脲酶活性測定采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法，以24 h后1 g土壤中NH4+-N的量（mg）表示脲酶活性（U）;蔗糖酶活性采用3，5-二硝基水楊酸比色法測定，以24 h后1 g土壤中葡萄糖的量（mg）表示蔗糖酶的活性（U）;過氧化氫酶活性采用高錳酸鉀滴定法測定，酶活性以20 min后1 g土壤消耗0.05 mol/L高錳酸鉀溶液的體積（mL）表示[27]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Excel 2007和SPSS 17.0進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncans法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢桿菌ZJM-P5對(duì)2種栽培環(huán)境下紅小豆根際土壤脲酶活性的影響

土壤脲酶主要來源于植物和微生物，其活性常用來表示土壤的供氮能力和水平。表2試驗(yàn)結(jié)果表明：與對(duì)照處理組合（N1B1、H1B1）相比，其他處理組合都增大了土壤脲酶活性，不同處理之間土壤脲酶活性差異顯著。同一施肥水平下，土壤脲酶活性均隨菌懸液濃度的增大呈先升高后降低的趨勢，且在菌懸液濃度為B3時(shí)酶活性達(dá)最大值;同一菌懸液濃度、相同施肥水平下，氮肥栽培環(huán)境下的土壤脲酶活性整體上高于腐殖酸栽培環(huán)境，且菌懸液濃度為B3時(shí)在N4水平下酶活性為0.730 mg/（g·d），達(dá)最大值，同其他施肥水平之間差異顯著。

另外，同不施肥處理（N1、H1）相比，2種栽培環(huán)境下的土壤脲酶活性均隨施肥量的增加而升高，但變化幅度不同。氮肥以N3、N4水平對(duì)土壤脲酶活性的影響最為明顯，其中以B3和N2、N3、N4組合處理下的增長幅度最大，分別比N1提高了30.48%、48.25%、60.09%;腐殖酸栽培環(huán)境下，當(dāng)菌液濃度為B3時(shí)，H2、H3、H4分別比H1增加了17.95%、42.82%、57.69%。

2.2 芽孢桿菌ZJM-P5對(duì)2種栽培環(huán)境下紅小豆根際土壤蔗糖酶活性的影響

蔗糖酶是一種水解酶，能促進(jìn)土壤中的蔗糖水解成葡萄糖和果糖，供作物吸收和利用。研究發(fā)現(xiàn)，同對(duì)照相比，2種栽培環(huán)境下不同處理組合的土壤蔗糖酶活性均明顯增大（多數(shù)差異顯著）。相同施肥水平下，蔗糖酶活性隨菌懸液濃度的增大表現(xiàn)為先增加后減少的單峰曲線變化，且同B1相比，腐殖酸各施肥水平下，蔗糖酶活性在B3濃度時(shí)均達(dá)峰值，與其他菌懸液濃度相比差異顯著;但施氮條件下，蔗糖酶活性僅在N3、N4時(shí)，在B3濃度下達(dá)到最大值，其余水平則在B4水平下達(dá)最大值（表3）。

相同菌懸液濃度下，雖然部分處理間酶活性仍表現(xiàn)出顯著差異，且2種栽培環(huán)境下酶活性均隨施肥水平增加而呈現(xiàn)先升高后下降趨勢，但不同栽培環(huán)境下變化規(guī)律略有差異，如施氮條件下，菌液濃度為B1、B2時(shí)，酶活性在N4達(dá)最大值;B3時(shí)在N3達(dá)最大值;B4時(shí)在N2達(dá)最大值;B5時(shí)在N3達(dá)最大值，說明適宜濃度的菌懸液可有效改善土壤蔗糖酶活性，且在一定程度上可降低氮肥用量;腐殖酸條件下，蔗糖酶活性不僅明顯高于各氮肥水平，而且相同菌液濃度下和相同施肥條件下酶活性分別在B3和H3水平時(shí)達(dá)最大值，說明H3B3組合處理可有效提高土壤酶活性，對(duì)促進(jìn)植物生長具有重要意義。

2.3 芽孢桿菌ZJM-P5對(duì)2種栽培環(huán)境下紅小豆根際土壤過氧化氫酶活性的影響

過氧化氫酶能夠酶促水解過氧化氫，酶活性的大小可以用來表征土壤的生化活性。研究發(fā)現(xiàn)，同一施肥水平下，菌懸液濃度從B1至B5，2種栽培環(huán)境下的酶活性總變化趨勢為先增大后減小，菌懸液濃度為B4時(shí)酶活性達(dá)最大值（除H3水平）。統(tǒng)計(jì)分析表明：施氮條件下，N2、N3水平在B4下酶活性與其他菌懸液濃度處理相比差異顯著（除N3B4與N3B5），與B1相比各增加了15.05%、19.39%;腐殖酸栽培環(huán)境下，各施肥處理在B4時(shí)與B1、B2、B5相比整體上具有顯著性差異，與B3相比差異?。ū?）。

同一菌懸液濃度下，腐殖酸栽培環(huán)境下的過氧化氫酶活性明顯高于氮肥栽培環(huán)境，部分施肥水平之間差異顯著。施氮肥時(shí)，酶活性隨施肥量的增加總變化趨勢為先增大后減小，在N3水平有最大值;腐殖酸栽培環(huán)境下，B4、B5濃度下H2、H3水平之間差異并不顯著，酶活性隨施用量的增加總體呈增大趨勢，在H4水平均達(dá)最大值。氮肥栽培環(huán)境在B4濃度下，N3和N4水平與其他施肥水平之間具有顯著性差異，其他菌懸液濃度處理下酶活性大小接近，差異不明顯;腐殖酸條件下，菌懸液濃度為B4時(shí)，在H4水平下酶活性為1.743 mL/（g·20 min）， 達(dá)最大值，與其他施肥水平相比具有顯著性（表4）。

3 結(jié)論與討論

土壤酶是指具有高度催化作用的一類蛋白質(zhì)，主要包括氧化還原酶類（脫氫酶、過氧化氫酶、過氧化物酶等）、水解酶類（蔗糖酶、脲酶、磷酸酶等）和轉(zhuǎn)移酶類（轉(zhuǎn)氨酶、轉(zhuǎn)糖苷酶等）等，其中以蔗糖酶、過氧化氫酶和脲酶等與土壤肥力、作物產(chǎn)量和品質(zhì)之間相關(guān)性較為密切，如武曉森等研究不同施肥處理對(duì)玉米產(chǎn)量及土壤酶活性的影響，表明秸稈還田配施化肥加秸稈腐熟劑有利于增加土壤纖維素酶、脲酶、過氧化氫酶活性及土壤養(yǎng)分含量，提高玉米產(chǎn)量[6]。邱珊蓮等研究表明，各種施肥處理均能不同程度地提高土壤中脲酶、過氧化氫酶、轉(zhuǎn)化酶等酶活性，有機(jī)無機(jī)配施更有利于提高土壤酶活性和土壤微生物數(shù)量，提升土壤生物肥力[28]。彭小蘭等在研究長期不同施肥處理對(duì)麥季土壤酶活性的影響中發(fā)現(xiàn)，施肥能有效調(diào)節(jié)土壤酶活性，相關(guān)分析表明土壤酶活性與小麥產(chǎn)量的相關(guān)性優(yōu)于土壤養(yǎng)分。因此改善土壤酶活性對(duì)作物高效栽培具有一定意義[29]。

土壤脲酶是決定土壤中氮轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶，其活性高低反映了各種生化過程的方向和強(qiáng)度。馬冬云等研究表明，在同一生育時(shí)期內(nèi)，小麥根際土壤脲酶活性的整體變化趨勢為隨施氮水平的提高而逐漸增加[30-31]。馬斌等研究表明，隨腐殖酸施用年限的增加，土壤脲酶活性呈增加的趨勢，與CK相比4種腐殖酸處理脲酶活性都增大[32]。本研究結(jié)果表明，不同氮肥、腐殖酸施用量下，與不施肥處理相比，每個(gè)處理組合都明顯提高了土壤脲酶活性。同一菌懸液濃度下，隨施肥量的增加，2種栽培環(huán)境的土壤脲酶活性都增大，這與前人研究結(jié)果相一致。2種栽培環(huán)境下相同施肥水平的土壤脲酶活性相比較，施氮處理的脲酶活性更高，這可能由于氮素含量的增加更大程度地刺激了作物根系和土壤微生物，分泌出更多與碳氮分解有關(guān)的酶。

蔗糖酶作為一種蔗糖水解酶，可有效增加土壤中易溶性營養(yǎng)物質(zhì)和促進(jìn)有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化，且與呼吸強(qiáng)度關(guān)系密切。本研究表明，2種栽培環(huán)境的土壤蔗糖酶活性較各自不施肥處理酶活性都增大，原因在于施肥后植株根系生長加快、根系分泌物增多及加快微生物的繁殖，使得根系土壤酶活性增大。其中同一施肥水平下隨菌懸液濃度的增大，酶活性變化趨勢為先升高后降低，在107 CFU/mL下酶活性達(dá)到最大值;施加氮肥時(shí)，在低濃度菌懸液處理下（0、106 CFU/mL）隨施氮量的增加酶活性逐漸增大，高濃度菌懸液（108、109 CFU/mL）下酶活性接近，相互間差異不顯著，這可能由于低濃度菌懸液促進(jìn)了根際土壤酶活性的提高，高濃度相對(duì)抑制了土壤酶的生物學(xué)活性，使得酶活性降低，因此適宜濃度的菌懸液可改善土壤酶活性，在一定程度上還可降低化肥的使用量。有關(guān)研究指出，土壤酶活性與肥料的施用量有關(guān)，如果肥料用量超過了最大臨界范圍，酶活性就會(huì)相對(duì)降低[33]。本研究結(jié)果表明，同一菌懸液濃度下，隨施肥量的增加，酶活性總體變化趨勢為先升高后降低。

過氧化氫酶作為土壤中的氧化還原酶類，在有機(jī)質(zhì)氧化和腐殖質(zhì)形成過程中起重要作用，可以促進(jìn)過氧化氫的分解，有利于防止對(duì)生物體的毒害作用[34]。本研究結(jié)果表明，不同施肥水平下，施肥處理的過氧化氫酶活性高于不施肥處理，說明施加肥料刺激了過氧化氫酶，使得酶活性提高;而施肥量相同時(shí)，隨菌懸液濃度的增大，土壤中過氧化氫酶活性變化趨勢為先升高后降低，其中在108 CFU/mL時(shí)酶活性達(dá)最大值（除H3水平），對(duì)土壤中過氧化氫酶活性具有最大促進(jìn)作用，有助于其催化過氧化氫反應(yīng)生成水和氧氣，在細(xì)胞內(nèi)起到解毒作用，從而改善植株土壤微環(huán)境。施用腐殖酸與施氮處理相比過氧化氫酶活性更高，這由于腐殖酸具有活化功能，可提高植物體內(nèi)氧化酶活性及代謝活動(dòng)，可以改良土壤、提高肥效[35]。試驗(yàn)結(jié)果表明，同一菌懸液濃度下隨腐殖酸施用量的增加，土壤過氧化氫酶活性呈增加趨勢，這與馬斌等的研究結(jié)果[33]一致。

通過對(duì)相同菌懸液濃度下2種肥料（氮肥和腐殖酸）之間的土壤酶活性結(jié)果比較，表明施用腐殖酸顯著提高土壤蔗糖酶和過氧化氫酶活性，而脲酶活性與施氮處理相比接近，且與芽孢桿菌ZJM-P5菌懸液組合處理會(huì)使效果更好，綜合考慮可見，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中應(yīng)提倡使用腐殖酸等有機(jī)肥料，減少化學(xué)氮肥的投入量。

綜上所述，氮肥和腐殖酸肥不同施用量與芽孢桿菌 ZJM-P5 菌懸液組合處理對(duì)紅小豆幼苗根際土壤產(chǎn)生較大的影響。施肥量為100 mg/kg氮、0.67 g/kg腐殖酸，菌懸液濃度均控制在107～108 CFU/mL時(shí)，土壤酶活性可達(dá)最大值。因此掌握這些規(guī)律，科學(xué)合理地施肥，更大作用發(fā)揮這些土壤酶的生物學(xué)活性，為紅小豆高產(chǎn)高效栽培和土壤改良提供理論基礎(chǔ)，進(jìn)而提高紅小豆施肥經(jīng)濟(jì)效益，也對(duì)將芽孢桿菌 ZJM-P5 進(jìn)一步研制成優(yōu)質(zhì)微生物肥料菌種和其生產(chǎn)應(yīng)用具有現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義。由于本研究主要進(jìn)行的是盆栽試驗(yàn)，所以今后還需要通過大田實(shí)驗(yàn)對(duì)芽孢桿菌ZJM-P5與肥料的互作機(jī)制以及對(duì)紅小豆產(chǎn)量及品質(zhì)的影響進(jìn)行深入探討。

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