尹 萍，路 璐，陳媛媛，李 麗，李 赟，童國(guó)慶

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 200120)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是以稀發(fā)排卵或不排卵、高雄激素血癥為臨床特征的生殖內(nèi)分泌疾病，患病率高達(dá)6%～10%，研究發(fā)現(xiàn)50%～60%的PCOS患者會(huì)合并胰島素抵抗(insulin resistance,IR)高胰島素血癥[1]。該病因及發(fā)病機(jī)制至今仍不完全清楚，因此，建立有效的生殖內(nèi)分泌及代謝異常型多囊卵巢綜合征動(dòng)物模型對(duì)其發(fā)病機(jī)制研究有重要意義。本研究采用來(lái)曲唑(letrozole)聯(lián)合45%高脂飼料飲食建模，探討更理想的生殖內(nèi)分泌及代謝異常的PCOS大鼠造模方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3周齡SPF級(jí)SD雌性大鼠26只,由上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。置于室溫(18～22)℃，相對(duì)濕度40%～60%的動(dòng)物房?jī)?nèi)，自由攝食、飲水，每天12 h光照。普通飼料供能比：蛋白(20%)、碳水化合物(70%)、脂肪(10%)，由上海斯萊克公司提供；高脂飼料供能比：蛋白(20%)、碳水化合物(35%)、脂肪(45%)，由深圳睿迪生物科技公司提供(D12451)。

SD大鼠隨機(jī)分為2組：對(duì)照組(普通飼料喂養(yǎng))8只，另18只大鼠用于建立PCOS大鼠模型(45%高脂飼料喂養(yǎng))。

1.2 藥物和試劑

來(lái)曲唑片(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H19991001)；羧甲基纖維素鈉(美國(guó)Sigma-aldrich公司)；胰島素酶免試劑盒(瑞典，Mercodia公司)，睪酮酶免試劑盒(美國(guó),Immunoway公司)，羅氏血糖儀及血糖試紙(美國(guó)，Roche公司)。

1.3 PCOS模型的建立

參考文獻(xiàn)[2]方法：3周齡SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，然后以高脂飼料喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組大鼠16周，第6周齡時(shí)開(kāi)始每日灌胃來(lái)曲唑溶液[1mg/(kg·d)來(lái)曲唑溶于0.5%羥甲基纖維素鈉溶液中]，連續(xù)13周；普通飼料喂養(yǎng)對(duì)照組大鼠16周，第6周齡時(shí)開(kāi)始每日灌胃0.5%羥甲基纖維素鈉溶液，連續(xù)13周，期間每周稱(chēng)重。從造模第15周開(kāi)始，每周對(duì)模型組和對(duì)照組大鼠尾靜脈采血，檢測(cè)空腹胰島素水平(FINS)和空腹血糖(FBG)，計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(insulin sensitivity index ,ISI)。ISI=ln[1/(FINS×FBG)]。

模型建立成功標(biāo)準(zhǔn)：模型組大鼠體重比對(duì)照組平均體重增加20%，模型組大鼠ISI比對(duì)照組ISI均值減去1.96個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，陰道涂片染色鏡檢處于動(dòng)情間期。第19周，12只大鼠滿(mǎn)足此條件，建模率達(dá)66.67%。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1陰道涂片

大鼠灌胃第12周，每天早上陰道涂片，HE染色，顯微鏡下觀(guān)察動(dòng)情周期的變化，連續(xù)14 d。

1.4.2體重增長(zhǎng)情況比較

每周測(cè)量大鼠的體重并且記錄。

1.4.3器官質(zhì)量及臟器指數(shù)測(cè)定

大鼠腹主動(dòng)脈采血取血后，將大鼠的雙側(cè)卵巢、子宮、下丘腦、垂體及腹股溝脂肪取出。組織常規(guī)稱(chēng)濕重，測(cè)定臟器指數(shù)。

1.4.4卵巢組織學(xué)檢查

卵巢組織常規(guī)去除表面脂肪稱(chēng)重后，一側(cè)卵巢置入4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋后切片，做HE染色，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀(guān)察各組大鼠卵巢組織學(xué)變化。

1.4.5大鼠腹腔糖耐量檢測(cè)(intra-peritoneal glucose tolerance test,IPGTT)

采用羅氏血糖儀及試紙測(cè)定，步驟如下:將大鼠禁食、禁水12 h，次日晨測(cè)取大鼠空腹血糖，然后將25%葡萄糖溶液按10 μl/g體重腹腔注射注入大鼠體內(nèi)，注射后分別于15、30、60、90、120 min時(shí)通過(guò)尾靜脈取血，測(cè)量血糖值。

1.4.6血脂分析

大鼠禁食12 h后，尾靜脈采血，離心分離血清，測(cè)定血清中三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)的含量。

1.4.7胰島素抵抗相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

造模結(jié)束次日晨8:00，大鼠測(cè)空腹血糖，并且從腹腔采血，測(cè)FINS以及FBG，并計(jì)算ISI。

1.4.8血清學(xué)性激素測(cè)定

大鼠禁食，2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈采血，以3 000 r/min離心15 min，分離血清，置-80℃?zhèn)溆?，檢測(cè)血清性激素睪酮(testosterone,T)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 大鼠動(dòng)情周期觀(guān)察

對(duì)照組大鼠始終保持規(guī)律的動(dòng)情周期變化。來(lái)曲唑灌胃后，模型組大鼠持續(xù)處于動(dòng)情間期，僅見(jiàn)大量白細(xì)胞，偶見(jiàn)少量角化細(xì)胞。

2.2 大鼠體重的變化

各組大鼠在建模前體重比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與對(duì)照組相比，模型組大鼠從高脂喂養(yǎng)第9周齡開(kāi)始，體重增加極顯著(P<0.001)，見(jiàn)圖1。

圖1 兩組大鼠每周體重比較

2.3 大鼠臟器質(zhì)量及臟器指數(shù)比較

模型組大鼠卵巢質(zhì)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；而模型組子宮及垂體質(zhì)量以及子宮指數(shù)、垂體指數(shù)顯著低于對(duì)照組(P<0.001)；對(duì)照組腹股溝脂肪顯著低于模型組(P<0.001)；下丘腦質(zhì)量在兩組間無(wú)顯著差異(表1)。

表1 各組大鼠臟器質(zhì)量及臟器指數(shù)比較

*P<0.05，***P<0.001，與對(duì)照組比較

2.4 卵巢形態(tài)學(xué)變化

對(duì)照組大鼠卵巢上為正常發(fā)育的卵泡，可見(jiàn)多個(gè)不同發(fā)育階段的卵泡，卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞呈多層(圖2 A、2B)。模型組卵巢為多囊樣改變，可見(jiàn)多個(gè)囊性擴(kuò)張的卵泡，顆粒細(xì)胞層減少，膜細(xì)胞層增厚(圖2C、2D)。

圖2 各組大鼠卵巢組織病理變化的比較

2.5 大鼠腹腔糖耐量檢測(cè)

各組大鼠空腹血糖濃度無(wú)明顯差異，模型組大鼠在IPGTT后的15、30、60、90、120 min時(shí)檢測(cè)的血糖值均極顯著高于對(duì)照組(P<0.001)，見(jiàn)圖3， 模型組糖耐量曲線(xiàn)下面積(AUC)極顯著增加(P<0.001)，見(jiàn)圖4。

圖3 各組大鼠IPGTT血糖比較 ***P<0.001，與對(duì)照組比較

圖4 各組大鼠糖耐量曲線(xiàn)下面積比較 ***P<0.001，與對(duì)照組比較

2.6 大鼠血脂代謝指標(biāo)比較

由表2可見(jiàn)，PCOS模型組大鼠與對(duì)照組比較，TG及LDL均顯著升高(P<0.05)，TC及HDL數(shù)值無(wú)差異。

表2 各組大鼠全身血清脂代謝水平變化

*P<0.05，與對(duì)照組比較

2.7 大鼠FINS及ISI變化比較

與對(duì)照組相比，模型組大鼠FINS活力顯著升高(P<0.001)，ISI敏感性顯著下降(P<0.001)，見(jiàn)表3。

2.8 大鼠血清睪酮水平的變化

由表4可見(jiàn)，模型組血清睪酮水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

表3 各組大鼠空腹胰島素水平及胰島素敏感指數(shù)的比較

***P<0.001，與對(duì)照組比較

表4 各組大鼠血清睪酮水平的比較

*P<0.05，與對(duì)照組比較

3 討論

PCOS是影響育齡期女性最常見(jiàn)的生殖內(nèi)分泌疾病，近年來(lái)的研究表明，該疾病與胰島素抵抗、肥胖、糖尿病、心血管疾病等密切相關(guān)。有50%～60%的PCOS患者存在不同程度IR，IR促進(jìn)高雄激素血癥產(chǎn)生，又與高雄激素血癥、高黃體生成素血癥等相互作用，影響下丘腦-垂體-卵巢軸功能，導(dǎo)致卵泡發(fā)育異常。在一項(xiàng)長(zhǎng)達(dá)15年的回顧性分析中，Hart等的研究結(jié)果顯示PCOS女性患上肥胖、糖尿病、高血壓的概率要顯著高于正常人群[3]。在Moran等的Meta分析結(jié)果也表明PCOS女性患上2型糖尿病的概率是正常人群的4倍[4]。PCOS不僅是生殖內(nèi)分泌疾病，更是一種治療上較為棘手的復(fù)雜代謝性疾病。

目前，國(guó)內(nèi)外報(bào)道的PCOS的動(dòng)物模型常用造模方法[5-10]中的雄激素(脫氫表雄酮、睪酮)造模法、孕激素聯(lián)合人絨毛膜促性腺激素(HCG)造模法、胰島素聯(lián)合HCG造模法及高脂飼料法，均有不同程度的胰島素抵抗，而雌激素(多采用戊酸雌二醇)造模法無(wú)明顯胰島素抵抗。多項(xiàng)研究[11-13]表明來(lái)曲唑造模可達(dá)到與臨床PCOS卵巢病理學(xué)改變最為接近的效果，來(lái)曲唑作為芳香化酶抑制劑，能夠阻斷雄激素向雌激素轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致類(lèi)固醇激素生成紊亂，卵巢局部雄激素增加，導(dǎo)致持續(xù)不排卵以及多囊樣改變，而來(lái)曲唑造模法糖脂代謝異常表現(xiàn)不明顯。大量實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道單獨(dú)給大鼠喂高脂肪和高蔗糖飼料[14-16]，可以造成大鼠肥胖高血糖及高胰島素血癥，可復(fù)制出較穩(wěn)定可靠的糖脂代謝異常大鼠模型，但其性激素水平變化及卵巢形態(tài)學(xué)改變不明顯。因此，依據(jù)PCOS和糖脂代謝異常在發(fā)病學(xué)方面的聯(lián)系，采用來(lái)曲唑灌胃聯(lián)合高脂飼料喂養(yǎng)的方法，更適合研究PCOS發(fā)病中生殖內(nèi)分泌及糖脂代謝的異常。林鶯等[2]利用來(lái)曲唑配合60%高脂飼料成功建立了胰島素抵抗型PCOS大鼠模型，朱磊等[17]單純利用不同高脂飼料構(gòu)建了SD大鼠肥胖模型，發(fā)現(xiàn)45%高脂飼料較60%飼料具有建?？臁⒔Ｂ矢叩奶攸c(diǎn)。Priya等[18]連續(xù)飼喂6周45%高脂飼料，肥胖模型大鼠生殖內(nèi)分泌功能顯著下降。因此，在本研究中運(yùn)用來(lái)曲唑配合45%高脂飼料造模方法，在高脂飼料喂養(yǎng)第6周時(shí)，模型組體重較對(duì)照組已出現(xiàn)顯著差異，在連續(xù)喂養(yǎng)16周后，成功確立了生殖內(nèi)分泌及代謝異常的PCOS模型大鼠，造模率達(dá)到66.67%。

在本研究中，在來(lái)曲唑聯(lián)合高脂飼料喂養(yǎng)后，模型組大鼠動(dòng)情周期失去規(guī)律性變化，陰道涂片并行瑞氏染色后見(jiàn)模型組大鼠均處于動(dòng)情間期，僅見(jiàn)大量白細(xì)胞，可確定大鼠無(wú)排卵，模型組大鼠子宮質(zhì)量減少，垂體及卵巢質(zhì)量增加，卵巢HE染色可見(jiàn)較多囊狀擴(kuò)張的卵泡，而其顆粒細(xì)胞層數(shù)明顯減少，此模型解剖及組織學(xué)改變與人PCOS相似，并且模型組大鼠的睪酮水平明顯上升，這與臨床PCOS內(nèi)分泌狀態(tài)相似，與國(guó)內(nèi)外研究一致[12-13,19]。在高脂飼養(yǎng)條件下，模型組大鼠體重及腹股溝脂肪質(zhì)量極顯著高于對(duì)照組，模型組大鼠AUC、FINS、ISI、TG及LDL等指標(biāo)均高于對(duì)照組，這些表型符合臨床胰島素抵抗PCOS的代謝特點(diǎn)。

綜上所述，利用來(lái)曲唑聯(lián)合45%高脂飼料誘導(dǎo)的PCOS大鼠模型表現(xiàn)出高雄激素、排卵障礙、卵巢多囊樣改變及糖脂代謝異常，是兼具研究PCOS內(nèi)分泌及代謝異常的動(dòng)物模型。