曾 亮， 柴繼寬， 趙桂琴， 李春杰， 劉文輝， 姚 拓*

(1.甘肅農業(yè)大學草業(yè)學院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室， 甘肅省草業(yè)工程實驗室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)研究中心， 甘肅 蘭州 730070； 2.蘭州大學草地農業(yè)科技學院， 甘肅 蘭州 730020； 3.青海省畜牧獸醫(yī)科學院， 青海 西寧 810016)

根腐病在苜蓿各主要種植區(qū)內均廣泛發(fā)生，且其常造成苜蓿產量下降、品質降低及利用年限縮短等嚴重影響[1]。近年來，隨著飼草產業(yè)結構的調整，苜蓿的種植面積和利用年限逐年增長，根腐病已開始成為影響苜蓿高產、優(yōu)質、穩(wěn)產的重要制約因素[2-3]。由于苜蓿根腐病通過土壤攜菌傳播，對其進行防治一直是該研究領域的難點，目前主要是依靠選育抗病品種、農業(yè)技術防治措施及噴施化學藥劑加以控制[4-6]，但在實際生產中缺乏真正有效的抗病品種，或者是該品種的抗病性極易喪失[7]；一些農藝控制措施，如土壤消毒和作物輪作，可以達到一定的控制效果，但會增加生產成本，很難適應當今集約化和高效的農業(yè)種植模式需求?；瘜W殺菌劑的過量應用不僅會引起諸如環(huán)境污染、食品藥物殘留以及增加經濟成本等問題，還會誘發(fā)病原菌產生抗藥性[8-10]。相比之下，生物防治除了能夠控制病害、增加產量外，對于人類和動植物也安全無害；同時，生物防治的普遍應用可以減少環(huán)境污染，延緩病原菌抗藥性的增強，間接產生一定的經濟、生態(tài)和社會效益，符合可持續(xù)農業(yè)和環(huán)境友好型社會的發(fā)展趨勢[11-14]。

目前對于苜蓿根腐病生物防治的研究和應用較少，僅有少量以芽孢桿菌[15-16]及生防放線菌[17]對其進行室內防效測定的報道，而對于其生防真菌的研究更屬空白。因此，分離和篩選苜蓿根腐病生防菌株并對其防病效果進行研究，從而研發(fā)出相關生防制劑對苜蓿根腐病進行防治具有極其重要的現(xiàn)實意義。為了探索和發(fā)現(xiàn)苜蓿根腐病生物防治的微生物資源，本試驗從苜蓿根際土壤中篩選鑒定出可以拮抗苜蓿根腐病病原菌的菌株，并進一步對其抑菌效果和盆栽防效進行研究，以期為今后生防菌肥的研發(fā)和應用提供菌種和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1供試土樣 2018年6月，分別在敦煌、張掖、定西和固原等地采集苜蓿根腐病植株帶土根系，裝入無菌密封袋放入冰盒中并立即于實驗室內分離純化。該區(qū)氣候干旱，日照充足，晝夜溫差大(10～20℃)，降水量少(40～200 mm/年)。

1.1.2供試病原菌株 供試苜蓿根腐病病原菌株4株，分別為苜蓿尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、燕麥鐮刀菌(F.avenaceum)、腐皮鐮刀菌(F.solani)、半裸鐮刀菌(F.semitectum)，均由甘肅農業(yè)大學草業(yè)學院保存。

1.1.3培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potato dextrose agar，PDA)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 ml，用于菌株的分離及活化；馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(Potato dextrose broth，PDB)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 ml，用于菌株的發(fā)酵[18]。

1.1.4供試苜蓿種子 供試苜蓿品種為甘農5號苜蓿，由甘肅農業(yè)大學草業(yè)學院提供。

1.2 試驗方法

1.2.1生防真菌分離純化 參照孫敬祖等的方法[19]，在自封袋外輕輕拍打苜蓿根系使其表面附著的土壤落入袋內作為根際待測土樣，稱取土壤樣品10.0 g倒入90 mL滅菌水錐形瓶內(瓶里放置小鋼珠)，室溫下160 r·min-1震蕩20 min充分搖勻，制得根際土壤懸液；再將自封袋內根系取出，用吸水紙吸后稱取0.5 g，70%酒精溶液浸泡20 s，再放入1 g·L-1升汞浸泡30 s進行根表消毒，用無菌水反復洗凈3次，再置于濾紙內吸去根表水分，放入滅過菌的研缽中，倒入5 mL無菌水充分研磨至液態(tài)。采用稀釋涂抹法在培養(yǎng)皿內(培養(yǎng)基為PDA)涂抹該液態(tài)根系樣品，在25℃下培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后挑取菌落形態(tài)、顏色、質地不同的菌株進行真菌初步分離，并對得到的菌株用劃線法進行純化，純化后的菌株接入試管內備用。

1.2.2生防真菌的篩選 采用對峙培養(yǎng)法對純化后的菌株進行抑菌率篩選[20]。將分離保存的菌株及靶標病原菌(尖孢鐮刀菌)活化后，接種在PDA培養(yǎng)基上距中點各2 cm處的同一水平線的兩點上，設置單獨接種尖孢鐮刀菌為對照，25℃培養(yǎng)7 d后通過十字交叉法測定菌落半徑并計算生長抑制率和覆蓋指數(shù)從而篩選出對尖孢鐮刀菌抑制率較高的菌株。生長抑制率(%)=(對照尖孢鐮刀菌菌落半徑-對峙培養(yǎng)尖孢鐮刀菌菌落半徑)/對照菌落半徑×100。覆蓋率分級標準[21]：Ⅰ級(+)：生防菌與靶標菌菌落不相觸；Ⅱ級(++)：生防菌與靶標菌菌落相接觸，且生防菌菌絲覆蓋靶標菌菌落小于50%，靶標菌菌落無明顯變化；Ⅲ級(+++)：生防菌菌落大面積覆蓋靶標菌，并在其上產生大量孢子，靶標菌生長衰敗。

1.2.3生防真菌鑒定 生防真菌的分類鑒定綜合其形態(tài)學特征與rDNA-ITS(Internal Transcribed Spacer)序列分子鑒定的結果。其中對真菌形態(tài)學的鑒定參照《真菌鑒定手冊》[22]的技術，把生防真菌接種在PDA培養(yǎng)基上，25℃下培養(yǎng)7 d，觀察菌落的顏色、紋路、生長速度等特征，同時采用掃描電鏡觀察其孢子的形態(tài)特征[23]。

分子序列分析鑒定采用真菌通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')對菌株進行PCR(聚合酶鏈式反應Polymerase Chain Reaction)擴增[24]，將擴增產物送至上海生工測序，所得序列登錄GenBank進行序列比對，并用MEGA 5.0軟件的Neighbor Joining生成系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4生防真菌對不同苜蓿根腐病病原菌的抑菌能力測定 采用對峙培養(yǎng)法對生防真菌的抑菌能力進行測定(方法同1.2.2)。與生防真菌對峙的靶標病原菌分別為尖孢鐮刀菌、燕麥鐮刀菌、腐皮鐮刀菌和半裸鐮刀菌，比較其對不同病原菌的抑菌能力差異。

1.2.5生防真菌對盆栽苜蓿根腐病的防治效果 挑選長勢均勻健康的苜蓿幼苗，栽入裝有滅菌土的營養(yǎng)缽中。分別刮取25℃ PDA平板上培養(yǎng)10 d的病原菌(尖孢鐮刀菌)與生防真菌培養(yǎng)物，制成孢子懸液，調整其孢子濃度分別至1.8×106CFU·mL-1和2.0×107CFU·mL-1。苜蓿幼苗移栽15 d后，用根部切傷小口后菌株懸浮液灌根的方法[25]分別接種病原菌和生防真菌以及多菌靈，以清水為對照，接種量為每盆10 mL。接種30 d后取出植株并清洗根部，觀察植株根部病情并計算病害嚴重度和病情指數(shù)，同時測定苜蓿株高、株鮮重及根重等生長指標。

苜蓿根腐病病害分級標準：[26]

0級：根系生長健壯，無病癥；

1級：主根斜切面有褐色環(huán)，側根顏色變深；

2級：主根萎蔫，顏色變黑褐色且出現(xiàn)壞死，側根大部分腐爛；

3級：根系大部分壞死，顏色黑褐色，植株枯萎死亡。

病情指數(shù)=100×∑(各級發(fā)病數(shù)×相應級別)/(調查總數(shù)×最高級數(shù))；

防治效果(%)=(對照病指-處理病指)/對照病指×100。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

試驗所得數(shù)據(jù)結果采用Excel 2010進行統(tǒng)計和作圖，SPSS V15.0版進行單因素方差分析(ANOVA)，Duncan新復極差法進行差異顯著性檢驗，其顯著水平設定為P=0.05。

2 結果與分析

2.1 生防真菌的分離篩選

從不同生境苜蓿根系土中分離得到真菌菌株95株，通過與尖孢鐮刀菌進行平板對峙試驗，8株菌株的抑制率在36.0%以上(表1)，其中2株抑制率超過60%，分別為ZY56(抑制率65.6%)和GY37(抑制率62.2%)，與其它菌株之間差異顯著，且這2株菌株對尖孢鐮刀菌的覆蓋指數(shù)均達到最高級別Ⅲ級(+++)，具有良好的抑菌效果和生防潛力。

表1 生防真菌對尖孢鐮刀菌的抑制率Table 1 The inhibitory percentage of biocontrol fungi on Fusarium oxysporum

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差，同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在P<0.05水平差異顯著。下同。“+”為覆蓋指數(shù)Ⅰ級；“++”為覆蓋指數(shù)Ⅱ級；“+++”為覆蓋指數(shù)Ⅲ級

Note:Data in the table are mean ±SD. Different letters in the same column indicate significant difference at the 0.05 level. The same as below. “+” covering index classⅠ;“++” covering index class Ⅱ;“+++” covering index class Ⅲ

2.2 生防菌株的鑒定

對具有較好生防潛力的2株菌株ZY56和GY37進行形態(tài)特征和ITS分子序列鑒定，鑒定結果如下：

2.2.1形態(tài)特征鑒定 ZY56菌絲生長迅速，菌落深厚、致密，培養(yǎng)1～3 d左右菌落為白色，之后開始產生深綠色分生孢子，菌落轉為綠色和灰黃色相間環(huán)斑，分生孢子球狀，粘液聚成孢子頭(圖1)；GY37菌落初呈淺白色，菌絲生長迅速，3～4 d基本長滿全皿，后期產生深綠色孢子，并在菌落中間有一圈明顯的綠色產孢區(qū)，周邊菌落呈淺黃色，分生孢子卵圓形，粘液聚成孢子頭(圖1)。依據(jù)上述形態(tài)特征及魏景超《真菌鑒定手冊》描述，將2株菌株初步鑒定為木霉屬(Trichodermaspp.)真菌。

圖1 ZY56和GY37的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of ZY56 and GY37注：A1：ZY56 培養(yǎng)3 d菌落；A2：ZY56培養(yǎng)7 d菌落；A3：ZY56分生孢子；B1：GY37 培養(yǎng)3 d菌落；B2：GY37培養(yǎng)7 d菌落；B3：GY37分生孢子Note:A1:3 d colony of ZY56. A2:7 d colony of ZY56. A3:Conidia of ZY56. B1:3 d colony of GY37. B2:7 d colony of GY37.B3:Conidia of GY37

2.2.2菌株分子生物學鑒定 以2株菌株的基因組DNA為模板，ITS1、ITS4為引物對分離菌株ITS區(qū)段序列進行PCR擴增，分別得到大小為622 bp(ZY56)和626 bp(GY37)的單帶，沒有非特異性擴增片段(圖2)。

圖2 菌株PCR擴增結果Fig.2 Amplification results of PCR

從Blast結果分析得出，菌株ZY56的rDNA-ITS序列與哈茨木霉(KM079608)相似性達100%，且二者處于系統(tǒng)發(fā)育樹上同一支線，綜合其形態(tài)特點將其鑒定為哈茨木霉；菌株GY37的rDNA-ITS序列與康寧木霉(EU520243)相似性達100%，且二者處于發(fā)育樹同一支線，綜合其形態(tài)特點將其鑒定為康寧木霉。

圖3 生防真菌同源性系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of biocontrol fungi

2.2.3生防真菌拮抗能力測定 如圖4所示，2種生防真菌對4種鐮刀菌病原菌均呈現(xiàn)出一定的抑菌效果。對峙培養(yǎng)1 d后，2種生防菌菌絲生長速度就已經開始超過4種病原菌；接種2 d后，生防菌菌落逐漸占領病原菌一側的平板，并且從第3 d開始兩種菌落相接觸，各病原菌菌落向中心點的生長均受到明顯的抑制；接種5 d后，生防菌菌落不斷侵占各病原菌所在面的平板，并開始逐漸包圍病原菌，在菌落交界處大量產孢，將病原菌包圍其中以控制其擴張。其中，ZY56與燕麥鐮刀菌(ZY56-Av)和半裸鐮刀菌(ZY56-Se)以及GY37與燕麥鐮刀菌(GY37-Av)的對峙在菌落交界處形成明顯的抑菌帶。

圖4 生防真菌對不同鐮刀菌的抑菌效果Fig.4 Antagonistic effects of biocontrol fungi on different Fusarium species注：圖片均于培養(yǎng)7 d后拍攝，對峙圖片左邊一側為生防真菌，右邊一側為不同鐮刀菌。Ox-尖孢鐮刀菌、Av-燕麥鐮刀菌、So-腐皮鐮刀菌、Se-半裸鐮刀菌Note:Photo after 7 d of culture,Biocontrol fungi on left side and Fusarium on right side in petri dish. Ox-F. oxysporum,Av-F. avenaceum,So-F. solani,Se-F. semitectum

對峙抑菌實驗結果表明(表2)：2種生防菌對4種病原菌的抑菌率在48.5%～75.3%之間，且抑菌率隨著對峙天數(shù)的增加而增大。對峙5 d時，ZY56對除燕麥鐮刀菌外的其它3種病原菌的抑菌率均高于GY37，此時，GY37對燕麥鐮刀菌的抑菌率為61.4%，顯著高于同時期其它的對峙培養(yǎng)抑菌率；對峙7 d時，ZY56對尖孢鐮刀菌和半裸鐮刀菌的抑菌率高于GY37，分別為65.6%和57.7%，而GY37對燕麥鐮刀菌和腐皮鐮刀菌的拮抗作用更強，抑菌率分別為75.3%和66.1%。

表2 生防真菌對不同病原菌的抑菌率Table 2 Inhibition rate of biocontrol fungi to different pathogens

2.2.4生防真菌對苜蓿根腐病的防治效果 從表3可以看出，致病處理F苜蓿根腐病病情指數(shù)達到33.6，與清水對照相比，其苜蓿植株的生長發(fā)育受到明顯的抑制，株高、株鮮重及根鮮重等各項指標均顯著低于對照水平。接種生防菌及多菌靈的3種處理，其病情指數(shù)在11.3～15.1之間，說明3種處理對苜蓿根腐病均有一定的防治效果，防效在55.1%～66.4%之間。其中接種哈茨木霉處理(ZY56+F)的病情指數(shù)最低，防效最高，其各項生長指標顯著高于多菌靈處理，且具有明顯生根的能力，根鮮重指標顯著高于對照；接種康寧木霉處理(GY37+F)的病情指數(shù)及防效略低于多菌靈處理，但差異不顯著，其各項生長指標與多菌靈和清水處理相比較也無顯著差異。

表3 生防真菌對苜蓿根腐病的防效Table 3 Control effect of biocontrol fungi on alfalfa root rot

注：F為接種尖孢鐮刀菌(Fusarium.oxysporum)的處理

Note:F for the inoculation ofFusarium.oxysporum

3 討論

鐮刀菌(Fusariumspp.)是一種常見的土傳病害病原真菌，也是引起苜蓿根腐病的重要致病菌[27]。Uddin與Knous[28]的研究表明，在美國內華達州苜蓿根腐病的致病菌主要為茄腐皮鐮刀菌、銳頂鐮刀菌(Fusariumacuminatum)、尖孢鐮刀菌和燕麥鐮刀菌。李敏權等[29]對隴中旱區(qū)苜蓿根腐病的研究結果顯示，該病的病原主要是尖孢鐮刀菌、銳頂鐮刀菌和半裸鐮刀菌。王多成等[30]對來自甘肅的苜蓿根腐病病原物的分析結果表明：發(fā)病部位分離到的菌株以鐮刀菌占優(yōu)勢，且經致病性測定和接種試驗證明，腐皮鐮刀菌致病性最強，其次是尖孢鐮刀菌和串珠鐮刀菌(Fusariummoniliformin)。本試驗所選用的靶標病原菌尖孢鐮刀菌、燕麥鐮刀菌、腐皮鐮刀菌和半裸鐮刀菌經接種檢測均為引起苜蓿根腐病的重要致病菌，以此為靶標病原菌進行生防真菌的篩選及相關防效研究，能夠獲得更高效的防病菌株，也更符合生產實際的需求。

木霉菌的抗病機制除了對病原菌的空間競爭、營養(yǎng)競爭和重寄生作用以外，抗生作用也是其抑制病原菌的一種重要方式[31-33]?？股饔檬侵改久乖谄渖L繁殖過程中會釋放一些次生物質或分泌一些酶類，來抑制周圍其他病原生物的生長，而病原菌通常對這些物質敏感，從而達到抑菌效果。這些物質包括一些揮發(fā)性物質，如乙醛[34]、6—戊烷基吡喃酮[35]等，還包括一些難揮發(fā)性物質和肽類物質，如Bissett和Benftez分別從T.Longibraciatum和T.viride中分離提純出的抗菌肽，并對其氨基酸序列進行了測定[36-37]。同時木霉產生的酶類物質包括幾丁質酶、葡聚糖酶、蛋白酶和纖維素酶等，這些酶類物質有利于木霉的重寄生和使病原菌的菌絲消解，與木霉菌的重寄生作用共同形成協(xié)同拮抗，在木霉的抗病機制中具有重要的作用[38-40]。本試驗的對峙培養(yǎng)研究可以看出，2種生防木霉除了對皿內空間及培養(yǎng)基養(yǎng)分的競爭外，ZY56與燕麥鐮刀菌(ZY56-Av)和半裸鐮刀菌(ZY56-Se)以及GY37與燕麥鐮刀菌(GY37-Av)的對峙在菌落交界處形成了明顯的抑菌帶，說明在這些對峙過程中木霉產生了某些抑菌物質，對于這些抑菌物質的具體成分和組成還需在后續(xù)試驗中做進一步深入的研究和分析。

有研究表明，木霉菌除了具有抑菌抗病作用外，還能促進植物根和葉的生長，從而提高植物抵抗不良生物和非生物環(huán)境脅迫的能力，如劉連妹等[41]的研究發(fā)現(xiàn)，用哈茨木霉的孢子懸浮液浸泡番茄幼苗，會顯著增加其植株各生長部位的增長，提高植株葉片中葉綠素含量和過氧化物酶、多酚氧化酶和超氧化物歧化酶活性。張鶴[42]的研究顯示，擬康寧木霉、哈茨木霉和棘孢木霉同時使用對草莓具有明顯的促進生根的效果，其植株根鮮重較單獨施用處理增加40.3%。梁志懷等[43]研究報道了豇豆被哈茨木霉發(fā)酵產物浸泡，其植株的根長、根重、根體積和活力等生長指標都呈現(xiàn)出增加的趨勢，其根系活力相比對照提高10.4%～19%。本試驗也與前人的研究得到了相似的研究結果，接種哈茨木霉處理后，苜蓿植株各項生長指標均高于清水對照，根鮮重更是顯著高于對照，提高了14.1%，說明哈茨木霉除了具有抑菌作用外，還會對植物產生一些促生作用。

4 結論

本試驗結果表明，菌株ZY56和GY37對4種苜蓿根腐病病原菌都具有較好的抑菌效果，抑菌率在54.9%～75.3%之間，盆栽防效分別達到66.4%和55.1%，生防效果顯著，且菌株ZY56處理的根鮮重指標顯著高于對照，具有一定的促進生根效果，因此對苜蓿根腐病的生物防治具有較好的應用開發(fā)潛力。