聶聰 王靜 侯寶翠 楊宇

（中國檢驗檢疫科學(xué)研究院 北京 100000）

1 前言

蓖麻是含油量高的農(nóng)作物， 但蓖麻籽果實中含有的蓖麻毒素（Ricin Toxin，RT）是最強的植物毒蛋白之一[1,2]，是氰化鉀毒性的近10 倍[3,4]。 成人致死量為1 mg，生食3～12 ?？蓪?dǎo)致其嚴(yán)重中毒或死亡[5]。蓖麻毒素蛋白約占蓖麻蛋白的5%，相對分子質(zhì)量65kDA，由A、B 兩條肽鏈構(gòu)成，其中，A 鏈?zhǔn)嵌拘宰饔玫年P(guān)鍵中心，B 鏈?zhǔn)墙Y(jié)合鏈[6,7]。 蓖麻毒素具有毒性強、存在范圍廣、易獲取、易純化的特點[8,9]，據(jù)文獻報道，蓖麻毒素中毒病例已有上百例，最著名的有“馬克夫毒傘案”[10]。近年來，我國也發(fā)生了誤食蓖麻致死的現(xiàn)象，并且蓖麻毒素中毒無解藥[11]，因此蓖麻毒素的檢測尤為重要。 目前蓖麻毒素的檢測方法有免疫標(biāo)記分析法、酶聯(lián)免疫吸附法、放射免疫檢測法、高效液相色譜法、生物質(zhì)譜技術(shù)、生物傳感法等，已被廣泛應(yīng)用。本研究利用免疫層析法與羧基熒光微球結(jié)合，通過熒光免疫層析試劑信號掃描儀獲取信號，15 min 完成了蓖麻毒素高靈敏、高特異性的定量檢測。

2 材料與方法

2.1 材料

蓖麻（山東），鼠抗蓖麻毒素IgG 單克隆抗體、兔抗蓖麻毒素IgG 多克隆抗體 （華大蛋白有限公司），巰基-β-D-半乳糖苷瓊脂糖親和介質(zhì)（Sigma）、SephacrylTMS-200 G75 凝膠柱（GE）；熒光微球（Bangs）；正常人血清（長春海關(guān)檢驗檢疫中心）；蓖麻毒素標(biāo)準(zhǔn)品（中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院）；相思子毒素、相思子凝集素由實驗室制備；羊抗鼠IgG 多克隆抗體（Sigma公司）；標(biāo)記墊（Ahlstrom）、NC 膜（Sartorius）、樣品墊及吸水墊（上海杰一生物）；牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）（北京沫之東）；其他化學(xué)試劑均為分析純試劑。

2.2 儀器

熒光免疫層析試劑信號掃描儀：熒光免疫檢測儀YG10（中國檢驗檢疫科學(xué)研究院）；包被機（上海金標(biāo)）；干燥箱（上海一恒生物）。

2.3 蓖麻毒素的制備

將蓖麻種子去殼后稱重，以硫酸銨沉淀收集蛋白，得到淡黃色粗毒素；然后根據(jù)蓖麻毒素、凝集素與其他雜蛋白對半乳糖結(jié)合能力不同， 進行巰基-β-D-半乳糖苷瓊脂糖介質(zhì)親和層純化；最后采用凝膠過濾的方法獲得高純度獲得蓖麻毒素蛋白。

2.4 抗蓖麻抗體制備

將獲得的蓖麻毒素抗原作為免疫原，分別免疫鼠抗蓖麻毒素單克隆抗體和兔抗蓖麻毒素多克隆抗體，并測試抗體的活性效價[12]。

2.5 免疫層析試劑制備

2.5.1 標(biāo)記物墊制備

首先取適量熒光乳膠微球[13]，進行羧基活化。以標(biāo)記緩沖液復(fù)溶，并且同時加入鼠抗蓖麻毒素單克隆抗體攪拌反應(yīng)，反應(yīng)后純化得到熒光乳膠微球標(biāo)記抗體，以標(biāo)記稀釋液稀釋后噴涂標(biāo)記墊之上，置干燥箱37℃烘干，干燥保存。

2.5.2 包被墊制備

以包被緩沖液將羊抗鼠IgG 多克隆抗體和兔抗蓖麻毒素IgG 多克隆抗體稀釋至工作濃度配置成質(zhì)控線工作液（C）和檢測線工作液（T），用包被機將質(zhì)控線和檢測線工作液劃膜至硝酸纖維素膜上，置干燥箱37℃烘干，干燥保存。

2.5.3 樣品墊制備

將樣品墊以樣品稀釋液處理后，置干燥箱37℃烘干，裁剪成所需尺寸，干燥保存，備用。

2.5.4 組裝

將樣品墊、標(biāo)記物墊、包被墊、吸水紙依次粘貼在PVC 底板上，切裁制得寬4 mm 的試劑條裝入卡殼中，詳見圖1。

2.6 檢測

將蓖麻毒素抗原以稀釋液稀釋后加入加樣孔，蓖麻毒素抗原首先與標(biāo)記物墊中的鼠抗蓖麻毒素單克隆抗體結(jié)合反應(yīng)形成聚合物， 然后層析經(jīng)過NC膜， 與包被在NC 膜線上的兔抗蓖麻毒素多克隆抗體結(jié)合形成復(fù)合物T， 其余沒有結(jié)合層析與羊抗鼠IgG 抗體結(jié)合形成復(fù)合物C。 樣品中蓖麻毒素蛋白濃度與T 信號強度成正比，15 min 后， 將試劑卡插入熒光免疫檢測儀YG10 分別掃描讀取T、C 信號值，利用擬合曲線即可獲得樣品中蓖麻毒素蛋白的濃度，可作為定量檢測，詳見圖2。 當(dāng)測試結(jié)果有效時，C 線顯示一定信號值，這時T 線上的信號強度與樣本的濃度相關(guān)，即：濃度越高，T 值越高。

圖1 層析試劑組裝原理

圖2 層析試劑反應(yīng)原理

2.7 性能評估

2.7.1 熒光層析試劑最低檢出限和工作曲線擬合

取蓖麻毒素標(biāo)準(zhǔn)品，制蓖麻毒素校準(zhǔn)品（0.5ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、4 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL、50.0 ng/mL），抽取3 個批次的熒光免疫層析檢測試劑進行依次測定，每個濃度重復(fù)5 次，以0 ng/mL 作為空白對照[14]。

2.7.2 熒光層析試劑重復(fù)性

抽取3 個批次的熒光免疫層析試劑，分別用高、中、低3 個濃度的質(zhì)控品進行檢測， 每個濃度點平行測定15 次，將試劑卡放入熒光免疫檢測儀YG10，分別掃描檢測（T）區(qū)和質(zhì)控（C）區(qū)，儀器讀取信號值。

2.7.3 特異性

抽取3 個批次的熒光免疫層析試劑檢測50ng/mL、500 ng/mL 的相思子毒素、相思子凝集素、蓖麻凝集素、葡萄球菌腸毒素、小牛血清白蛋白、胎牛血清、蛋白胨，每個樣品檢測3 次。

2.7.4 穩(wěn)定性

將包裝好的試劑在常溫環(huán)境中保存，在14 個月內(nèi)定期檢測高、低兩種濃度的質(zhì)控品，每個濃度測試3 次，計算平均值和相對平均偏差[15]。

2.7.5 樣本檢測

分別選取人血清、動物血清、BSA、奶粉、牛奶、蘋果汁、橙汁、餅干、果凍為模擬樣本，向人工模擬樣品中分別添加1 ng/mL、10 ng/mL 的蓖麻毒素，每個濃度做3 個平行，同時做3 個空白對照，測定蓖麻毒素含量，計算回收率和重復(fù)性[16]。

3 結(jié)果

3.1 蓖麻毒素蛋白制備結(jié)果

經(jīng)過硫酸銨蛋白粗提、親和層析和凝膠過濾，獲得電泳純度的蓖麻毒素蛋白，結(jié)果詳見圖3。凝膠柱獲得3 個吸收峰分別是120 kDa 的凝集素蛋白峰、64 kDa 蓖麻毒素蛋白峰和鹽峰；蛋白電泳條帶1為蓖麻毒素蛋白；電泳條帶2 為DTT 條件下，蓖麻毒素蛋白分子內(nèi)的二硫鍵被打開，A 單鏈分子量為30 kDa、B 單鏈分子量分別為32 kDa。經(jīng)TotalLab2.0圖像軟件分析純度為96%。

圖3 蓖麻毒素純化結(jié)果

3.2 抗體制備結(jié)果

獲得的天然蓖麻毒素蛋白包被96 孔板，酶聯(lián)免疫法測定抗體的效價，結(jié)果詳見表1，兔多克隆抗體和鼠單克隆抗體的效價均為10-6IU。

表1 兔、鼠多克隆抗體效價（IU）

3.3 性能評估

3.3.1 熒光層析試劑最低檢出限和工作曲線

擬合0.5 ng/mL 的樣品可以部分檢出，1 ng/mL的樣品全部檢出，其最低檢出限≤1 ng/mL。 以蓖麻毒素濃度為橫坐標(biāo)， 熒光免疫檢測儀YG10 讀數(shù)信號T/C 為縱坐標(biāo)，建立擬合曲線，詳見圖4，方程為：Y=-62.687X2+5 501.4X+3 600.4；R2=0.991 7。 當(dāng)蓖麻毒素的濃度為0～10 ng/mL 時， 蓖麻毒素濃度與T/C呈線性關(guān)系，線性回歸方程為Y=5 940.3X+1 839.9；R2=0.995 1，詳見圖5。

圖4 熒光免疫層析試劑擬合曲線

圖5 熒光免疫層析試劑線性

3.3.2 熒光層析試劑重復(fù)性

在線性范圍內(nèi)檢測3 個濃度10 ng/mL、5 ng/mL、1 ng/mL， 檢測同一個濃度時，T 浮動明顯，C 基本保持不變，詳見圖6；將每個濃度檢測15 次，分別將獲得的T、C、T/C 的方差與平均值的比值作為變異系數(shù)，即CV，結(jié)果發(fā)現(xiàn)T、C 的信號值的CV≥15%T/C的CV≤8%，具體詳見表2，所以T/C 對T 起到了矯正的作用。 利用T/C 的擬合曲線計算3 個批次檢測試紙條的批內(nèi)和批間濃度的變異系數(shù)。 批內(nèi)、 批間CV 均不大于10%。

3.3.3 特異性

檢測50 ng/mL、500 ng/mL 的相思子毒素、 相思子凝集素、蓖麻凝集素、葡萄球菌腸毒素、蓖麻毒素、小牛血清白蛋白、胎牛血清、蛋白胨，反應(yīng)均為陰性，詳見表3。 證明熒光層析試劑與這些蛋白均無交反應(yīng)，異性良好。

圖6 精密度結(jié)果

表2 重復(fù)性結(jié)果

表3 各種相近毒素特異性結(jié)果

3.4 穩(wěn)定性

定期檢測濃度為1 ng/mL 和25 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品，結(jié)果各濃度質(zhì)控品的測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于20%，表明該試劑的穩(wěn)定性為14 個月（表4）。

表4 穩(wěn)定性結(jié)果

3.5 樣本結(jié)果檢測（表5）

結(jié)果顯示，各模擬樣本與空白對照結(jié)果均小于1 ng/mL； 其他各濃度的回收率均為85%～115%；重復(fù)性小于10%。

4 討論

蓖麻毒素作為一種廣泛存在于自然中、 容易獲得的致命毒素，人們對它的檢測研究從未懈怠過。本研究利用親和層析法、 凝膠過濾法純化法獲得蓖麻毒素蛋白， 將獲得的毒素蛋白分別免疫昆明小鼠和白兔，獲得單克隆抗體和多克隆抗體，將獲得的抗體分別作為包被抗體和捕獲抗體建立了熒光免疫層析試劑，配合熒光免疫檢測儀YG10 作為定量試劑，靈敏度為1 ng/mL，對試劑進行3 個批次，500 份/批的放大實驗， 并對3 批試劑進行性能評價：重復(fù)性實驗、特異性檢測、穩(wěn)定性實驗、樣本檢測能力實驗等。在重復(fù)性實驗中發(fā)現(xiàn)，檢測高、中、低3 個濃度，每個濃度檢測15 次，在檢測相同濃度時，儀器掃描獲得C 信號值的CV 為8%～11%、T 信號值CV 為10%～14%,T/C 比值的CV 為8%～11%，T/C 重復(fù)性明顯更好，原因在于：（1）在結(jié)合墊制備過程中不均勻；（2）樣本的差異；（3）檢測時環(huán)境溫度、濕度等。 所以C 除了有質(zhì)控試劑的功能，對檢測結(jié)果起到了矯正作用，避免了上述問題。所以，以濃度和T/C 擬合曲線檢測蓖麻毒素1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL 的批內(nèi)、批間精密度均不大于10%；特異性實驗檢測相近蛋白50 ng/mL、500 ng/mL 的相思子毒素、相思子毒素、相思子凝集素、蓖麻凝集素、葡萄球菌腸毒素、蓖麻毒素、小牛血清白蛋白、胎牛血清、蛋白胨，每個樣本檢測3 次，反應(yīng)均為陰性，試劑特異性良好；并且對常規(guī)食品、血清等做了模擬樣本檢測，發(fā)現(xiàn)試劑檢測食品能力良好，檢測靈敏度同樣為1 ng/mL；最后對試劑進行了14 個月常溫穩(wěn)定性實驗，在14 個月內(nèi)，試劑的檢測能力沒有變化。 此外，該試劑成本低、操作簡單、常溫儲存、方便攜帶，適用于野外環(huán)境操作，可以完成Ricin 的定量檢測，并且靈敏度高、快速、準(zhǔn)確，可以應(yīng)用于食品和環(huán)境中蓖麻毒素的檢測。

表5 樣本檢測結(jié)果