付媛媛 徐錦波 張敏 陳述政 程雪

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，并且是女性腫瘤患者死亡的主要原因。隨著對乳腺癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制的深入研究，腫瘤免疫微環(huán)境已成為研究熱點(diǎn)問題之一。免疫微環(huán)境在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和患者的預(yù)后中都起到?jīng)Q定性的作用。腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocyte,TILs）主要反映局部免疫反應(yīng)，在腫瘤進(jìn)展過程中起了至關(guān)重要的作用[1]。CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)Ⅰ型免疫反應(yīng)，可增強(qiáng)CD8+和CD4+T細(xì)胞的積聚，促進(jìn)其抗腫瘤作用[2]。在乳腺癌中，腫瘤浸潤性CD8+T細(xì)胞與患者生存期[3]和對治療的反應(yīng)密切相關(guān)[4]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

（regulatory T cell，Tregs）是T淋巴細(xì)胞的亞家族之一，也被稱之為抑制性T淋巴細(xì)胞。叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子p3（forkhead box protein3，F(xiàn)oxp3） 是 CD4+CD25+Tregs的特異性生物標(biāo)志，其在腫瘤免疫中也發(fā)揮了重要作用[5]。本研究采用免疫組化法評估乳腺癌組織中Foxp3陽性Tregs和CD8+T細(xì)胞的表達(dá)情況，分析其與乳腺癌患者臨床病理因素及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2010年1月至2013年12月在本院乳腺外科住院并行手術(shù)治療的患者78例，均為女性，術(shù)后病理檢查確診為浸潤性導(dǎo)管癌，年齡28~81（52.2±20.3）歲；排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前采用過任何形式的化療患者。收集患者腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤分期、分化程度及其他臨床病理資料，臨床分期采用TNM國際分期標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)2013年St.Gallen乳腺癌國際會(huì)議上規(guī)定的乳腺癌分子分型分類標(biāo)準(zhǔn)[6]，將乳腺癌分為5類：Luminal A、Luminal B（HER-2 陰性）、Luminal B（HER-2陽性）、HER-2過表達(dá)及Base-like（三陰）型?；颊咝g(shù)后均接受以紫杉類（包括紫杉醇、多西他賽）和（或）蒽環(huán)類（包括表柔比星、吡柔比星、多柔比星）為基礎(chǔ)的化療，每3周為1個(gè)療程，整個(gè)治療時(shí)間有4~8個(gè)周期。人類表皮生長因子受體2（HER-2）陽性患者均聯(lián)合使用曲妥珠單抗靶向治療。

1.2 主要試劑 一抗選用兔抗人Anti-Foxp3 antibody[SP97]（ab99963）、小鼠抗人Anti-CD8 antibody（ab59480）均購自英國ABcam公司；即用型快捷免疫組化試劑盒（Maixin Reagent）購自福州邁新生物技術(shù)有限公司；二氨基聯(lián)苯胺（3,3-diaminobenzidine,DAB）顯色劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 Foxp3與CD8+表達(dá)的檢測 采用免疫組化法。10%甲醛溶液固定標(biāo)本，常規(guī)石蠟包埋后連續(xù)切取6~8張4μm薄片，分別置于陽離子防脫片后脫蠟、水合，然后用檸檬酸鹽緩沖液修復(fù)Foxp3和CD8，將玻片完全浸沒于3%雙氧水中，避光室溫孵育10min。血清封閉，分別向玻片滴加稀釋后的一抗 Foxp3（1∶100）及CD8（1∶100），放在保濕盒內(nèi)后置 4℃冰箱孵育，第 2 天取出保濕盒，并在常規(guī)沖洗后用二抗37℃孵育30min。DAB染色后，再用蘇木素染色胞核1~2min，分化后再次溫水返藍(lán)15～30s，最后置于顯微鏡下觀察染色及分化程度。梯度乙醇脫水，并用中性樹膠封片后保存。光學(xué)顯微鏡下（×400）觀察拍照。Foxp3在細(xì)胞核中呈棕色或棕褐色為陽性表達(dá)，CD8在細(xì)胞膜呈棕色或棕褐色為陽性表達(dá)。陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)方法如下[7]：在顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野（×400），采用Image-Pro Plus 6.0軟件對免疫組化切片目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行掃描，并行密度分析，得到陽性細(xì)胞百分比（目標(biāo)區(qū)域陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)/總細(xì)胞個(gè)數(shù)）。

1.4 觀察指標(biāo)及隨訪 觀察并記錄患者的年齡（以40歲為分界[8]）、腫瘤大小、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、分化程度、是否存在癌栓、雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、HER-2、分子分型情況。所有患者手術(shù)治療后均以門診復(fù)診及電話方式進(jìn)行隨訪，隨訪截至?xí)r間為2018年10月，78例患者隨訪時(shí)間為22~106個(gè)月，中位隨訪時(shí)間90個(gè)月，死亡和失訪共21例，復(fù)發(fā)4例，記錄中位無病生存期（DFS）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，不呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)表示；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用log-rank檢驗(yàn)；采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析免疫組化切片結(jié)果。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Foxp3和CD8+在乳腺癌組織中的表達(dá)情況 Foxp3表達(dá)陽性細(xì)胞百分比為（31.12±6.23）%，以 Foxp3陽性細(xì)胞＞31%為Foxp3高表達(dá)組，≤31%為Foxp3低表達(dá)組；CD8表達(dá)陽性細(xì)胞百分比為（39.24±15.22）%，以 CD8+細(xì)胞＞39%為CD8+高表達(dá)組，≤39%為CD8+低表達(dá)組。Foxp3和CD8+高、低表達(dá)結(jié)果見圖1（見插頁）。

2.2 乳腺癌組織Foxp3、CD8+表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系 乳腺癌組織中，F(xiàn)oxp3高表達(dá)組與Foxp3低表達(dá)組比較，兩組患者在腫瘤大小、腫瘤分期、淋巴結(jié)陽性、分化程度、是否存在癌栓及分子分型方面比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；CD8+高表達(dá)組與CD8+低表達(dá)組比較，兩組患者在腫瘤大小、腫瘤分期、淋巴結(jié)陽性、分化程度及是否存在癌栓方面比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。而雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、HER-2的表達(dá)與Foxp3、CD8+的表達(dá)均無明顯相關(guān)性（均P＞0.05），見表 1。

2.3 Foxp3、CD8+表達(dá)與DFS的關(guān)系 Foxp3高表達(dá)組患者的中位DFS為85個(gè)月，F(xiàn)oxp3低表達(dá)組患者的中位DFS為99個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.687，P＜0.05）；CD8+高表達(dá)組患者的中位DFS為99個(gè)月，CD8+低表達(dá)組患者的中位DFS為80個(gè)月，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.180，P＞0.05），見圖 2、3。

2.4 不同F(xiàn)oxp3、CD8+表達(dá)組合亞組DFS的比較 根據(jù)Foxp3和CD8+的表達(dá)水平，進(jìn)一步將患者分為4個(gè)亞組：Foxp3高表達(dá)CD8+高表達(dá)組（16例）、Foxp3高表達(dá)CD8+低表達(dá)組（28例）、Foxp3低表達(dá)CD8+高表達(dá)組（9例）、Foxp3低表達(dá) CD8+低表達(dá)組（25例），結(jié)果顯示Foxp3高表達(dá)CD8+低表達(dá)組患者中位DFS是56.5個(gè)月，雖然低于Foxp3高表達(dá)CD8+高表達(dá)組（99.5個(gè)月）、Foxp3低表達(dá)CD8+低表達(dá)組（99個(gè)月）及Foxp3低表達(dá)CD8+高表達(dá)組（90個(gè)月），但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.708，P＞0.05），見圖 4。

3 討論

乳腺癌患者存在免疫缺陷已被多項(xiàng)研究證實(shí)，且乳腺癌組織中有大量免疫細(xì)胞浸潤[9-10]。研究表明，乳腺癌組織中細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞浸潤提示預(yù)后良好[11]，TILs數(shù)量與預(yù)后呈正相關(guān)[12]。然而，也有一些研究表明，TILs數(shù)量與患者總生存期呈負(fù)相關(guān)[13]。其中，F(xiàn)oxp3在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用[14-15]，而腫瘤浸潤性CD8+T細(xì)胞與術(shù)后生存時(shí)間[15]及對治療的反應(yīng)方面有著緊密聯(lián)系[16]。TILs對預(yù)后的影響取決于浸潤細(xì)胞的類型、功能狀態(tài)、腫瘤組織中浸潤細(xì)胞的定位及其與腫瘤細(xì)胞的相互作用。

圖2 Foxp3高表達(dá)與Foxp3低表達(dá)組的DFS曲線

圖4 Foxp3高表達(dá)CD8+高表達(dá)、Foxp3高表達(dá)CD8+低表達(dá)、Foxp3低表達(dá)CD8+高表達(dá)、Foxp3低表達(dá)CD8+低表達(dá)組的DFS曲線

Foxp3是Tregs細(xì)胞的相對特異性生物標(biāo)志。Tregs可以抑制其他免疫細(xì)胞的活性，維持免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定性，并可能在抑制腫瘤特異性免疫過程中起重要作用。乳腺癌組織和外周血中均存在大量的Tregs[17]，但是Foxp3并不能完全代表Tregs細(xì)胞[18]。既往研究發(fā)現(xiàn)，Tregs的過表達(dá)[19]與乳腺癌的發(fā)生及預(yù)后[20]相關(guān)。通過對乳腺癌腫瘤標(biāo)本采用免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，原位癌患者中Foxp3陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多的患者其復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較高。DFS和總生存期在浸潤性癌Foxp3陽性細(xì)胞顯著增加的患者中也相對較短[17]。上述研究表明，乳腺癌患者中，F(xiàn)oxp3高表達(dá)意味著較差的預(yù)后。然而，一項(xiàng)關(guān)于ER陰性乳腺癌的研究表明，F(xiàn)oxp3高表達(dá)的基底樣乳腺癌患者中有更長的DFS[21]。因此，目前關(guān)于Foxp3在乳腺癌中預(yù)后的研究結(jié)果并不一致。本研究中，F(xiàn)oxp3細(xì)胞浸潤與腫瘤大小、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、否存在癌栓以及分子分型等方面相關(guān)，提示預(yù)后不良。這進(jìn)一步證實(shí)了既往研究結(jié)論[17]。進(jìn)一步生存分析顯示，F(xiàn)oxp3低表達(dá)組患者的中位DFS明顯高于Foxp3高表達(dá)組，也進(jìn)一步證實(shí)了Foxp3與患者預(yù)后生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。

圖3 CD8+高表達(dá)與CD8+低表達(dá)組的DFS曲線

腫瘤微環(huán)境中的TILs主要是CD8+T細(xì)胞，既往研究表明CD8+腫瘤淋巴細(xì)胞浸潤意味著預(yù)后較好[22-24]。然而，也有研究表明CD8+在不同的乳腺癌亞型中有不同的結(jié)果和預(yù)后。例如，有研究就提出乳腺癌患者的CD8+細(xì)胞的數(shù)量與存活率無關(guān)。然而，在另外一項(xiàng)基底樣乳腺癌中，其結(jié)果卻是CD8+預(yù)示有更好的預(yù)后[25]。因此，許多以前的大規(guī)模研究對CD8+與生存之間的關(guān)系有不同的結(jié)論。在本研究中，CD8+浸潤情況與腫瘤大小、腫瘤分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及是否存在癌栓等有關(guān)，并且與提示預(yù)后較差的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、存在癌栓等因素呈負(fù)相關(guān)。在隨后的亞組分析中也顯示，F(xiàn)oxp3低表達(dá)組的患者中位DFS顯著長于Foxp3高表達(dá)組。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxp3低表達(dá)CD8+高表達(dá)亞組有著最佳的預(yù)后，明顯優(yōu)于其他3組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。筆者認(rèn)為，由于本研究中病例數(shù)較少，而且在本研究中Foxp3可能來源于不同的T細(xì)胞，從而導(dǎo)致其免疫狀態(tài)不同，因此其對預(yù)后的影響尚不明確。

總之，檢測乳腺癌患者的免疫狀態(tài)有助于預(yù)測乳腺癌患者的預(yù)后?；颊叩拿庖郀顟B(tài)、腫瘤的臨床特征、病理類型、治療方法等因素決定了乳腺癌患者的預(yù)后。因此，對乳腺癌患者免疫狀況進(jìn)行更深入的研究將有助于臨床醫(yī)生為乳腺癌患者選擇更具針對性的個(gè)性化治療方案。本研究與國際先進(jìn)水平仍存在一定的差距，期待在接下來的研究中能夠進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，研究更多免疫指標(biāo)對患者預(yù)后的影響，從而使更多患者受益。