王勇 吳波 孫華麗 胡煒 熊華才 李傳頂 劉艷梅 陳衛(wèi)軍 應申鵬

鼻咽癌是常見的頭頸部惡性腫瘤之一，也是免疫相關性腫瘤[1]。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）在腫瘤細胞浸潤、轉移及血管形成等過程中起重要作用，其過度表達與包括鼻咽癌等多種惡性腫瘤預后相關。近年來，多項基礎研究表明EGFR參與腫瘤免疫調節(jié)，與人類白細胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）存在相關性[2]。EGFR抑制劑可以上調包括HLA在內的主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ類和Ⅱ類基因的表達[3]。HLA多態(tài)性也可以影響EGFR抑制劑治療的免疫調節(jié)表現(xiàn)：皮疹反應[4]。HLA-F是HLAⅠ類分子之一，HLA-F編碼的蛋白主要為人類組織相容性抗原，可以影響T淋巴細胞的分化及免疫因子的釋放，從而介導免疫系統(tǒng)反應、免疫應答及免疫損傷。在人類很多腫瘤中可檢測到HLA-F過度表達，基礎研究表明HLA-F與鼻咽癌相關，但鮮有相關臨床研究報道。本研究擬分析EGFR和HLA-F在鼻咽癌組織中的表達水平及預測鼻咽癌調強放射治療預后的價值，為腫瘤個體化治療提供依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料 我院2007年1月至2017年12月收治鼻咽癌放療患者120例，其中男85例，女35例，年齡27～88歲，中位年齡55歲。組織學類型：角化性鱗癌16例，非角化性鱗癌104例。根據(jù)UICC第7版分期標準，Ⅰ期18例，Ⅱ期22例，Ⅲ期55例，Ⅳa期25例。單純放療37例，放療加化療83例。

1.2 HLA-F和EGFR的免疫組織化學檢測方法 鼻咽癌組織標本為患者治療前在鼻咽鏡活檢時獲得。HLA-F和EGFR免疫組織化學檢測試劑分別為兔抗人HLA-F 單克隆抗體（mAb EPR6803,1∶300，英國 Abcam公司產品）和鼠抗人EGFR蛋白單克隆抗體（18986-1-AP，中國武漢三鷹生物技術有限公司產品），均按照試劑盒操作說明進行操作。以IgG1封閉HLA-F抗原后作為陰性對照，皮膚癌組織用于陽性對照EGFR；陰性對照使用PBS代替一抗。EGFR和HLA-F蛋白陽性染色均呈棕黃或棕褐色，且定位于細胞質和（或）細胞膜。

1.3 結果判斷 結果判別由病理科醫(yī)師采用獨立雙盲半定量評估，每張切片隨機取5個400倍視野,以染色強度結合陽性細胞數(shù)百分比綜合計分[5]，0分為陰性（-），1～4 分為弱陽性（+），5～8 分為中度陽性（++），9～12分為強陽性（+++）。0～4分定義為低表達，5～12分定義為高表達。

1.4 治療方法和隨訪 所有入組病例均經病理確診后，接受根治性調強適形放射治療，參考RTOG 0615劑量標準[6]，設計并優(yōu)化調強計劃。所有患者腫瘤劑量為70Gy，2.12Gy/F，頸部淋巴結轉移灶照射劑量66Gy，2Gy/F，預防區(qū)照射劑量50Gy，2Gy/F。臨床分期為Ⅱ~Ⅳ期病例采取同步放化療，酌情誘導化療或放療后輔助化療，誘導化療或輔助化療為以鉑類為基礎的雙藥或三藥聯(lián)合方案，同步化療方案為每周順鉑30～40mg/m2，其中19例患者因基礎疾病和其它特殊原因未接收化療。入組患者放療結束后開始隨訪，前2年每3個月及第3年開始每半年進行一次隨訪，不能來院復診患者電話隨訪。來院隨訪內容包括全面的體檢及輔助檢查，每半年復查一次鼻咽部MRI。隨訪時間以診斷日期開始計算至死亡或末次隨訪日期。中位隨訪時間為43.4個月（10.6~100個月）。無進展生存期（progression-free survival，PFS）定義為：從確診開始至腫瘤（任何方面）進展或（因任何原因）死亡之間的時間。總生存期（overall survival，OS）定義為：從確診開始至（因任何原因）死亡的時間。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以 表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。Kaplan-Meier生存曲線分析PFS和OS，生存率的比較采用log-rank檢驗。采用單因素、多因素Cox比例風險模型評估EGFR和HLA-F兩因素預測預后的相對風險。蛋白表達水平的關系分析采用Spearman等級相關。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 生存和死亡患者臨床特征比較 根據(jù)隨訪結果將患者分為生存組和死亡組，兩組患者臨床特征比較見表1。

由表1可見，生存和死亡患者的性別和病理類型的差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），而年齡、T分期、N分期和臨床分期比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

2.2 120例鼻咽癌患者EGFR和HLA-F表達水平與臨床特征關系 見表2。

由表2可見，EGFR≥（++）表達率為70.8%（85/120），HLA-F≥（++） 表達率為 66.7%（80/120）。EGFR、HLA-F表達水平與患者的性別、年齡、組織病理學分型間均無相關性（均P＞0.05），而與患者T分期、N分期、臨床分期間有相關性（均P＜0.05）。

表1 生存和死亡患者臨床特征比較（例）

表2 120例鼻咽癌患者EGFR、HLA-F表達水平與臨床特征的關系（例）

表3 120例鼻咽癌患者EGFR、HLA-F表達水平預測PFS、OS的單因素分析

2.3 HLA-F和EGFR表達水平預測鼻咽癌調強放療預后的單因素分析 見表3。

由表3可見，單因素分析顯示T分期、N分期、EGFR表達水平、HLA-F表達水平、EGFR+HLA-F表達水平是預測鼻咽癌患者PFS、OS的影響因素，年齡是OS的影響因素。

2.4 HLA-F和EGFR表達水平預測鼻咽癌調強放療預后的多因素分析 見表4。

由表4可見，多因素分析顯示，T分期是預測PFS的獨立影響因素，EGFR+HLA-F表達水平是預測OS的獨立影響因素。

2.5 HLA-F和EGFR與鼻咽癌調強放療預后的關系Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，高EGFR、高HLA-F患者的PFS和OS均差于低表達組（圖1、2，見插頁）。根據(jù)EGFR、HLA-F表達水平分組，分為高EGFR+高HLA-F、高 EGFR+低 HLA-F、低 EGFR+高 HLA-F 和低EGFR+低HLA-F 4組，采用Kaplan-Meier生存曲線分析，高EGFR+高HLA-F患者的PFS和OS均差于其它組（圖3，見插頁）。進一步分析顯示，死亡組EGFR高表達34例（85.0%），HLA-F高表達為 35例（87.5%），EGFR+HLA-F高表達34例（85.0%）;生存組EGFR高表達50例（62.5%），HLA-F高表達45例（56.3%），EGFR+HLAF高表達33例（41.3%）。

表4 120例鼻咽癌患者EGFR、HLA-F表達水平預測PFS、OS的多因素分析

2.6 HLA-F和EGFR蛋白表達相關性 HLA-F和EGFR表達水平在鼻咽癌組織中呈正相關（r=0.28，P=0.002）。

3 討論

放射抗拒是導致鼻咽癌預后不良的重要原因，研究表明，EGFR高表達與鼻咽癌放射抗拒相關，EGFR抑制劑可以提高鼻咽癌的放射敏感性，進而提高生存獲益[7-8]。當前腫瘤治療進入免疫時代，研究表明在鼻咽癌免疫調節(jié)方面，EGFR和HLA存在相關性，且共同參與腫瘤的免疫調節(jié)[2]。

EGFR突變或過表達可以誘導腫瘤放療抵抗，導致預后不良[9]。本研究利用免疫組化方法檢測EGFR在鼻咽癌組織中的表達情況，結果顯示EGFR總陽性表達率為88.3%，高表達率為70.8%。陽性表達率與文獻報道的68%~89%相似[10]。本研究顯示EGFR表達水平和T、N分期有關，Zhang等[11]進行的一項回顧性研究表明，EGFR表達于89.5%的鼻咽癌患者，且于與鼻咽癌的T和有無頸部淋巴轉移（N分期）有關，其EGFR陽性表達患者3年生存率更低（75.8%vs 91.2%），且為獨立的不良預后因子（β=3.93；χ2=11.95；P=0.001）。Cao 等[12]的研究顯示EGFR與鼻咽癌的T分期有關，與N分期無關。本研究中EGFR高表達組5年PFS和OS時間均差于低表達組，死亡組中高EGFR表達高于低表達的5倍。單因素分析顯示EGFR表達是PFS和OS影響因子（P=0.017、0.003），但多因素分析EGFR不是獨立影響因子。雖與上述這些研究的結果并不完全一致。但可以肯定的是EGFR過表達是鼻咽癌患者的不良預后因素，支持許多觀察性研究提示EGFR是判斷預后較為理想的生物學標志物的結論[13]。

HLA-F屬于非經典型HLAⅠ類抗原，主要功能是參與免疫調節(jié)，維持免疫耐受免疫系統(tǒng)失調影響鼻咽癌的發(fā)生與發(fā)展[1]。多項基礎研究表明HLA-F與鼻咽癌易感性存在密切聯(lián)系[14-15]。Li等[16]通過構建CNE-2-Rs和6-10B-Rs兩個鼻咽癌細胞株，分析了miRNA和對應的mRNA，結果發(fā)現(xiàn)HLA-F mRNA高表達，表明HLA-F與鼻咽癌相關。一項針對2 340例中國南方NPC患者和1 166例健康志愿者的研究篩選出包括HLA-F在內的7個HLA差異性單核苷酸多態(tài)性（SNP），依據(jù)Hardy-Weinberg equilibrium（HWE）假設進一步分析發(fā)現(xiàn)，HLA-F影響鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展[15]。從基因學水平肯定了HLA抗原，尤其是HLA-F，在鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。既往研究發(fā)現(xiàn)HLA-F分子存在異常表達水平，并明顯影響患者預后，且不同類型間的腫瘤表現(xiàn)出不同的臨床相關性，包括如非小細胞肺、乳腺癌、前列腺癌和結直腸癌等許多癌癥類型中都被過度表達[17-18]。Ishigami等[19]對日本胃癌患者的研究發(fā)現(xiàn)HLA-F與胃癌患者預后呈相關性，并且發(fā)現(xiàn)HLA-F表達和腫瘤浸潤程度、淋巴結轉移、血管和淋巴管侵犯等相關。徐永富等[21]研究顯示HLA-F在肝細胞癌中的表達是獨立預后影響因子。本研究顯示HLA-F陽性總表達率為85.3%，高表達率為66.7%。HLA-F高表達組患者PFS、OS明顯差于低表達組。死亡組中HLA-F高表達是低表達的7倍。HLA-F表達水平與性別、年齡、病理分型無關，而與T、N分期相關，表明HLA-F表達水平與鼻咽癌存在臨床相關性。單因素分析顯示，HLA-F高低表達水平是患者PFS、OS的影響因素（P=0.044、0.000），但多因素分析顯示HLA-F不是其獨立影響因素。

本研究表明EGFR和HLA-F表達水平有顯著的相關性。單因素分析顯示T分期、N分期、EGFR素表達水平、HLA-F表達水平是PFS、OS的影響因素，但多因素分析提示患者T分期（P=0.001）是PFS的獨立影響因素，EGFR+HLA-F表達水平是患者OS的獨立預后影響因素（P=0.025）。高EGFR+高HLA-F表達患者5年PFS、OS分別為54%、29%均較其它組合低。死亡組中高EGFR+高HLA-F的高占比，提示EGFR、HLA-F高表達能提高鼻咽癌的放射抗拒性，這可能與EGFR與HLA協(xié)同參與相關腫瘤免疫反應有關。Srivastava等[21]報道在頭頸部腫瘤中，EGFR通過抑制SHP-2/STAT1誘導HLA下調，HLAⅠ類分子上調與EGFR抑制劑療效顯著相關，即EGFR抑制劑可以阻斷EGFR誘導的免疫逃逸機制并通過重建STAT1信號以逆轉HLA下調，從而達到適應性細胞免疫。

綜上所述，本研究首次為HLA-F表達水平影響鼻咽癌患者調強放療預后提供了證據(jù)，HLA-F的表達水平在鼻咽癌中具有臨床意義。聯(lián)合檢測EGFR和HLAF表達水平有助于鼻咽癌調強放療預后的分析。HLA-F和EGFR的相關性即信號通路交互影響機制有待進一步研究。本文一部分患者的隨訪時間還不夠長，可能對結果存在影響。