俞敏祎，余凱凱，費 聰，柯威宇，吳業(yè)飛，張鎮(zhèn)子，包澤航，林海琛，李飛飛，陳國林，呂尊富

（浙江農林大學 農業(yè)與食品科學學院，浙江 杭州311300）

氮素的吸收、同化與運轉直接影響著作物的生長發(fā)育狀況，對作物生長至關重要。傳統(tǒng)計算植株氮質量分數(shù)的方法需要破壞性取樣，且要進行室內化學分析，具有一定程度上的滯后性和緩慢性。葉綠素儀具有快速、簡便和無損的特點，常被用來監(jiān)測診斷作物氮素營養(yǎng)［1］。前人基于作物高產條件下建立的土壤、作物分析儀器開發(fā)（SPAD）值與產量的關系確定了適宜SPAD值［2-4］。近年來，在小麥Triticum aestivum，玉米Zea mays，茅草Imperata cylindrica，水稻Oryza sativa等作物上利用SPAD值估算作物氮質量分數(shù)快速無損診斷氮素營養(yǎng)狀況已經(jīng)被廣泛應用［3］，但傳統(tǒng)的葉片氮營養(yǎng)診斷方法有不少的缺點，例如準確度低，診斷費時費力，且破壞樣本和診斷相對滯后［5-7］。若采用SPAD測量儀診斷氮素營養(yǎng)方法則較為省時省力且能夠實時監(jiān)測，但SPAD測量儀所測量出的數(shù)據(jù)受很多環(huán)境因素影響，在某些情況下會出現(xiàn)準確度低和穩(wěn)定性較差等缺點。前人主要以單葉SPAD作為診斷方法進行研究［8］，凌啟鴻等［9］研究表明頂 3葉與頂4葉的葉色差可以準確診斷水稻植株氮素的豐虧，李剛華等［8］研究表明頂3葉可作為較為理想指示葉診斷水稻氮素營養(yǎng)狀況，姜繼萍等［10］研究表明水稻頂4葉和頂3葉間的差值與施氮水平之間存在明顯的相關性，李杰等［11］研究表明頂3葉SPAD值乘頂4葉SPAD值/頂部4張葉片平均SPAD值與田塊表觀供氮量之間具有顯著的線性關系。前人大都基于頂3葉與頂4葉對水稻氮素營養(yǎng)診斷進行研究，而不同葉位構建歸一化SPAD指數(shù)（normalized differential SPADij，INDSPADij）與氮素營養(yǎng)之間關系的研究較少。本研究通過不同葉位建立歸一化SPAD指數(shù)與水稻氮素營養(yǎng)之間的定量關系，通過歸一化SPAD值估算氮質量分數(shù)，從而快速精確地診斷水稻氮素營養(yǎng)，并通過不同葉位與氮素營養(yǎng)狀況的相關性高低判定更能指示水稻植株氮質量分數(shù)的葉位，以期為水稻氮素營養(yǎng)診斷提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗設計與品種

于2015年在浙江省德清縣浙江農林大學現(xiàn)代農業(yè)科技園，選用2個水稻品種： ‘甬優(yōu)538’‘Yongyou 358’，5月28日播種，大田用種量為18.0 kg·hm-2，秧齡為25 d，2本·叢-1，移栽稻密度為18.0萬穴·hm-2；行距28.0 cm×株距20.0 cm。 ‘秀水134’ ‘Xiushui 134’，5月28日播種，大田用種量為45.0 kg·hm-2，秧齡25 d，4本·叢-1，移栽稻密度為25.5萬穴·hm-2。行距28.0 cm ×株距14.0 cm。2品種獨立試驗，設置5個氮肥水平，重復3次，采用隨機區(qū)組設計，小區(qū)15個·品種-1。小區(qū)之間以田埂相隔，埂上覆膜，獨立排灌。南北行向，小區(qū)東西長8.0 m，南北寬4.0 m，面積為32.0 m2。耕作層土壤有機質為 20.10 g·kg-1， 全氮為 1.19 g·kg-1， 堿解氮為 104.64 mg·kg-1， 速效磷為 46.45 mg·kg-1，速效鉀為 81.49 mg·kg-1。

1.2 氮肥施用

設置 5個氮肥水平， 施肥量分別為0（N0對照），70.0（N1），140.0（N2）， 210.0（N3）， 280.0（N4） kg·hm-2。m（基肥）∶m（糵肥）∶m（穗肥）=4∶2∶4（表1）。在施用基肥時，一次性施入過磷酸鈣990.0 kg·hm-2； 氯化鉀基肥用 175.0 kg·hm-2，穗肥用 175.0 kg·hm-2，所有小區(qū)水平一致。

表1 不同時期氮肥用量Table 1 Nitrogen consumption at different stages

1.3 構建葉位SPAD歸一化指數(shù)

通過分析頂部4張葉片SPAD值的變化特征，明確葉位SPAD歸一化指數(shù)與植株氮質量分數(shù)的定量關系，構建最優(yōu)的葉位SPAD組合指數(shù)，實時可靠地反映水稻植株氮素營養(yǎng)狀況。

葉位 SPAD 組合指數(shù)的計算方法如下： 葉位 SPAD 歸一化指數(shù)INDSPADij=（ISPADi-ISPADj）/（ISPADi＋ISPADj）。 其中：ISPADi和ISPADj分別代表水稻冠層主莖第i和j葉位的SPAD值，i，j≤4。

1.4 數(shù)據(jù)測定

1.4.1 水稻葉片SPAD值測定 用MINOLTA產SPAD-502型葉綠素計，在水稻拔節(jié)前期、拔節(jié)期、孕穗期、抽穗期、開花期和灌漿前期，選取4株健康主莖測定其頂部4張完全展開葉上部1/3處、中部和下部1/3處的SPAD值，取平均值作為各葉片的SPAD值［8］。

1.4.2 水稻葉片生物量和氮質量分數(shù)測定 水稻拔節(jié)前期、拔節(jié)期、孕穗期、抽穗期、開花期、灌漿前期、灌漿中期和成熟期，分別選取代表性水稻植株4株·小區(qū)-1，根據(jù)植株器官發(fā)育情況，將樣品植株分離為葉、莖和穗，放入恒溫干燥箱內烘干，在105℃殺青30 min，80℃烘干48 h至恒量后稱量。樣品粉碎后使用半微量凱氏定氮法測定水稻植株不同器官的全氮質量分數(shù)。

2 結果與討論

2.1 不同施氮水平下水稻冠層葉片SPAD值在整個生育期的動態(tài)變化

圖1和圖2顯示：L1～L4分別代表水稻冠層的頂1，頂2，頂3及頂4葉片，N0～N4分別代表5個施氮水平0，70.0，140.0，210.0，280.0 kg·hm-2。從圖1可以看出： ‘甬優(yōu)538’在不同時間SPAD值出現(xiàn)明顯差異，進入衰老期后期SPAD值進入持續(xù)下降階段，大部分植株在衰老期前后L4的SPAD值下降數(shù)值明顯大于L1，L2和L3。 ‘秀水134’SPAD值呈現(xiàn)先降低后增加再降低趨勢，進入衰老期后，SPAD值下降明顯。

從圖1～2可以看出： ‘甬優(yōu)538’和 ‘秀水134’絕大部分L4的SPAD數(shù)值大于L3和L2，其中L1的數(shù)值在生育期中大部分低于L2，L3和L4。因為氮素都是從下往上運輸?shù)?，所以最接近根部的L4的SPAD值大于其他葉片。又因為L1測定SPAD值時展開程度不同，L1對光能的利用效果不佳從而導致葉片顏色偏淺，SPAD數(shù)值低于其他葉片數(shù)值。

2015年的大田試驗（對照除外），在移栽后30 d至移栽后90 d的生育期內，植株冠層葉片的SPAD值可以從葉片葉色的變化中看出，經(jīng)過各個生育期葉色比對可以發(fā)現(xiàn)葉色經(jīng)歷了 “二黑二黃”2次交替波動的變化，施氮量的增加葉色的變化程度明顯隨之加大。大田水稻在移栽后的30 d，即水稻處于分集高峰期，水稻葉片經(jīng)歷了的第一次葉色 “黑黃”交替變化，這一時期水稻SPAD值達到一個峰值，從大田材料可觀察到冠層葉色較深，隨后變淡。水稻冠層葉片的深淺交替變化有助于分蘗數(shù)的增加，促進秧苗在育苗階段的生長，保證在生育后期擁有充足的穗數(shù)。在植株進入這一階段時植株氮代謝活躍，冠層葉片生長旺盛，分蘗數(shù)有所增加。其中 ‘甬優(yōu)538’N4和 ‘秀水134’N3，N4的分蘗高峰期往后偏移。分蘗數(shù)量和施氮量等影響分蘗的終止日期，在分蘗的中后期，水稻植株對土壤供氮水平要求較高以求達到分孽所需的含氮水平。因而隨著施氮量的增加，分孽的終止日期將延遲，分蘗期因此有所延長。所以高氮水平下水稻的分蘗高峰期也隨之向后偏移［12-13］。

圖1 ‘甬優(yōu)538’水稻冠層葉片SPAD值在不同的5個施氮水平下的動態(tài)變化趨勢Figure 1 Trend of dynamic change of SPAD value of canopy leaf of ‘Yongyou 538’ rice under different 5 nitrogen fertilizer levels

由于品種條件的影響， ‘秀水134’秧苗生長較 ‘甬優(yōu)538’偏慢，水稻處于抽穗期時（即 ‘甬優(yōu)538’在移栽后的75 d后， ‘秀水134’在移栽后的85 d后），葉片開始大量積累營養(yǎng)物質，葉片在這一階段葉綠素和氮質量分數(shù)有所升高，葉片顏色較深，為之后的抽穗期提供物質儲備。在植株進入抽穗期，穗部將大量接收葉片的營養(yǎng)物質，葉色又變淡（SPAD值下降），即水稻植株冠層葉片發(fā)生了第2次黑黃交替。 “二黑二黃”是水稻植株莖稈生長增粗、防倒伏、稻穗增重增大的時期。通常 “二黑”（2次顏色較深的時期）促進光合作用的進行，從而有效促進了碳水化合物的累積。若在生育期中 “二黑”未出現(xiàn)或不明顯，表明植株生長發(fā)育減緩，會造成以下后果：葉片偏小，抽穗期提早，穗部發(fā)育不良穗粒不足，導致產量降低。圖1和圖2可以看出：不同的施氮水平的水稻均會表現(xiàn)2次葉片顏色交替的現(xiàn)象（即SPAD值2次升降），不同的施肥水平和不同的施肥時間只會影響冠層葉片顏色深淺交替變化的幅度和出現(xiàn)的時間，并不能使這一變化的規(guī)律消失。有研究［9］認為，無論在何種施氮水平下，水稻冠層葉在生育期均會產生 “黑黃”交替變化趨勢，因為這是其自身內在因素控制的，不同的施氮水平無法使這一現(xiàn)象消失。

圖2 ‘秀水134’水稻品種冠層葉片SPAD值在不同的5個施氮水平下的動態(tài)變化趨勢Figure 2 Trend of dynamic change of SPAD value of canopy leaf of ‘Xiushui 134’ rice under different 5 nitrogen fertilizer levels

圖1和圖2表明：2個品種在不同施氮條件下，水稻L1的SPAD值普遍小于L4和L3。分析原因，在移栽后35 d左右，葉位靠下的L4及L3已經(jīng)比較成熟且已完全展開［10］，因而SPAD值較大。而L1為新生葉片，葉位靠上，因其可能為完全成熟且未完全展開，并且從大田實地觀察也可以得出：L1葉面積較小，顏色較其他葉片較淺，導致SPAD值在大部分情況下小于L3和L4。

‘甬優(yōu)358’在N0條件下及 ‘秀水134’在N0和N1條件下，水稻的L2的SPAD值大于L3及L4。分析原因，水稻植株缺氮條件下，L2會優(yōu)先接收氮素營養(yǎng)，頂部葉片光合作用效率高于底部葉片，所以L2的SPAD值明顯偏大。隨著施氮水平的提高，L2～L4的SPAD差值變小，在而在氮素供給充足的情況下，L3和L4的SPAD值明顯變大，出現(xiàn)了L3和L4的SPAD值大于L2的現(xiàn)象，推測是因為施氮量的增加，充足的氮素不僅可以滿足新葉的生長也可以保證靠近根部的下位葉的氮素營養(yǎng)?？梢?，充足的氮素供應可以使不同葉位的功能葉生長發(fā)育更加平衡。另外也可以推測：L3和L4相比L2對氮素營養(yǎng)狀況的相關性更高，因而更適合作為植株氮營養(yǎng)診斷的理想指示葉。通過不同葉片SPAD值表現(xiàn)可以看出氮素優(yōu)先供應上部葉片，前期營養(yǎng)生長氮素主要供應L2，后期生殖生長氮素主要供應L1，當?shù)爻渥愕臅r候下部葉片能得到足夠的養(yǎng)分供應，而當植株出現(xiàn)氮素虧缺，老葉最先衰老，下部葉片表現(xiàn)最為明顯，因此，L4對氮素反應最為敏感，其次是L3，L4可以作為水稻植株氮素營養(yǎng)變化的指示葉片。此外，L1與L4的SPAD值差值比較發(fā)現(xiàn)，兩者之間的差值隨氮水平的升高逐漸減小。根據(jù)這一現(xiàn)象，可以利用上位葉和下位葉差值大小來判斷葉片氮質量分數(shù)的高低，為下一步推斷水稻施氮是否充足提供依據(jù)。

田間試驗表明：水稻播種期、移栽期、拔節(jié)期、孕穗期、開花期和成熟期分別為5月28日、6月21日、8月10日、8月27日、9月7日和10月20日。圖3可以看出：隨著施氮水平的增加水稻冠層葉片SPAD值逐漸增加，這說明施氮量越高，水稻葉片葉綠素質量分數(shù)也越高。

2.2 不同施氮水平下水稻冠層葉片氮質量分數(shù)的變化趨勢及與歸一化SPAD值之間關系

由圖4可知：在各生育時期地上部冠層葉片氮質量分數(shù)隨著施氮量的增加不斷增加，5個施氮水平之間存在顯著差異（P＜0.05）。過量施氮會引起水稻干物質增加變緩，而冠層葉片氮濃度仍呈不斷增加趨勢。

研究證實：水稻冠層不同葉位葉片SPAD差值與葉片氮質量分數(shù)為指數(shù)式回歸關系，且此關系受年份、品種和生育時期影響較?。?4］。本研究結果表明：以INDSPAD14與冠層葉片氮質量分數(shù)之間相關系數(shù)最為顯著（圖5和圖6）。

圖3 不同施氮量水平下 ‘甬優(yōu)538’和 ‘秀水134’水稻冠層葉片SPAD值在的動態(tài)變化趨勢Figure 3 Trend of dynamic change of leaf SPAD values of ‘Yongyou 538’ and ‘Xiushui 134’ under different 5 nitrogen fertilizer levels

圖4 不同施氮水平下水稻冠層葉片氮質量分數(shù)隨移栽后天數(shù)的變化趨勢Figure 4 Variation trend of nitrogen concentration of rice leaf under different nitrogen levels with the days after transplantation

為了減少品種和環(huán)境等因素對SPAD與植株氮質量分數(shù)關系的影響，對大田試驗的 ‘甬優(yōu)358’和‘秀水134’分別構建了歸一化SPAD指數(shù)（INDSPADij）與植株氮質量分數(shù)之間關系，結果發(fā)現(xiàn)INDSPAD14與N0～N4所有不同施氮量組別之間呈顯著正相關（P＜0.05）， ‘甬優(yōu)358’水稻品種決定系數(shù)R的范圍為0.69～0.96， ‘秀水134’決定系數(shù)R的范圍為0.64～0.94，INDSPAD14與植株氮質量分數(shù)的定量關系受施氮量和環(huán)境的影響較小而保持穩(wěn)定，可以用INDSPAD14來估算水稻植株氮質量分數(shù)。相比前人利用單葉SPAD和遙感等方法估算氮質量分數(shù)，本研究利用INDSPAD14估算水稻植株氮質量分數(shù)，簡單快速，可以減少取樣對植株帶來的破壞以及植株品種、土壤、天氣等對診斷的影響，僅測量水稻植株L1和L4SPAD，即可估算出實際氮質量分數(shù)。另外，INDSPAD14指數(shù)對水稻植株氮素營養(yǎng)的估算效果優(yōu)于INDSPAD13指數(shù)，進一步證明了L4較L3更能指示植株氮質量分數(shù)。李剛華等［8］研究表明：L3可作為較為理想指示葉診斷水稻氮素營養(yǎng)狀況，與本研究結果不同。

水稻L1與L4的歸一化SPAD指數(shù)與水稻冠層葉片氮質量分數(shù)存在顯著的相關關系，能較好估計水稻冠層葉片氮質量分數(shù)，模型不易受環(huán)境因素影響，具有較高穩(wěn)定性。后續(xù)研究將建立INDSPAD14與水稻氮營養(yǎng)指數(shù)之間的定量關系，用于水稻氮素營養(yǎng)診斷。

3 結論

不同的施氮量的水稻均會表現(xiàn)出2次葉片顏色交替的現(xiàn)象（即SPAD值2次升降），這是其自身內在因素控制的，不同的施氮量無法使這一現(xiàn)象消失。水稻植株缺氮條件下，植株靠近根部的葉位L3和L4的SPAD值小于植株頂部葉片（L2）葉片的SPAD值。隨著施氮量的提高，出現(xiàn)了L3和L4的SPAD值大于L2的現(xiàn)象。推測出L3和L4相比L2對氮素營養(yǎng)狀況的相關性更高，更適合作為植株氮營養(yǎng)診斷的理想指示葉。

圖5 ‘甬優(yōu)358’水稻INDSPAD14與冠層葉片氮質量分數(shù)的定量關系Figure 5 Quantitative relationship between the N content of leaf and INDSPAD14in ‘Yongyou 358’

圖6 ‘秀水134’水稻INDSPAD14與冠層葉片氮質量分數(shù)的定量關系Figure 6 Quantitative relationship between the leaf N content of rice and INDSPAD14in ‘Xiushui 134’

發(fā)現(xiàn)INDSPAD14與N0～N4所有不同施氮量組別之間呈顯著正相關， ‘甬優(yōu)358’水稻品種決定系數(shù)R為0.69～0.96， ‘秀水134’品種決定系數(shù)R為0.64～0.94，INDSPAD14與植株氮質量分數(shù)的定量關系受施氮量和環(huán)境的影響較小而保持穩(wěn)定，用INDSPAD14估算氮質量分數(shù)較為準確，頂4葉相較其他葉片更能指示水稻植株氮質量分數(shù)。