俞狄虎，張 遲,，柯甫志，敬露陽，顧雪嬌，吳寶玉，張 敏

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 省部共建亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300；2.浙江農(nóng)林大學(xué) 浙江省農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改良技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州311300；3.浙江省柑橘研究所，浙江 臺(tái)州318020；4.浙江省麗水市蓮都區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，浙江 麗水323000）

雄性不育在開花植物中普遍存在，主要表現(xiàn)為雄蕊發(fā)育不正常，不能產(chǎn)生具有正常功能的花粉［1］?！疅o子甌柑’Citrus suavissima‘Seedless’是甌柑Citrus suavissima的芽變品種，保留了甌柑肉質(zhì)飽滿、香味特異、耐儲(chǔ)藏的優(yōu)良品質(zhì)，因果實(shí)無核被人們青睞。研究認(rèn)為，雄性不育是 ‘無子甌柑’無核的重要原因之一［2］。張遲等［3］發(fā)現(xiàn) ‘無子甌柑’花粉敗育始于小孢子母細(xì)胞時(shí)期，推測其雄性不育與能量代謝異常和營養(yǎng)物質(zhì)缺乏有關(guān)。對矮牽牛Petunia hybrid［4］，枸杞Lycium barbarum［5］，辣椒Capscum annuum［6］和蘿卜Raphanus sativus［7］等植物的研究發(fā)現(xiàn)， 查爾酮合成酶基因（CHS）的異常表達(dá)會(huì)引起雄性不育；CHS是黃酮類化合物代謝通路中的關(guān)鍵基因，通過影響查爾酮的產(chǎn)生從而影響黃酮類化合物的生物合成［4］，而黃酮類化合物的缺乏/過量是植物雄性不育的重要原因之一。有研究將克隆自10個(gè)柑橘種質(zhì)的CHS基因與溫州蜜柑 ‘國慶4號(hào)’Citrus unshiu‘Guoqing 4’， 柚 ‘馮威’Citrus maxima‘Fengwei’和甜橙 ‘紅寶石’Citrus sinensis‘Ruby’的CHS比對，發(fā)現(xiàn)不同品種柑橘的CHS基因編碼區(qū)核苷酸序列相似度極高，達(dá)98%以上［8］。本研究以前期工作為基礎(chǔ)，以克里曼丁橘Citrus clementina數(shù)據(jù)庫為參照，對 ‘無子甌柑’和甌柑小孢子母細(xì)胞時(shí)期的花藥進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組測序，篩選CHS同源差異表達(dá)基因進(jìn)行克隆和表達(dá)量分析，并對CHS基因家族進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期為 ‘無子甌柑’雄性不育機(jī)理的深入研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 數(shù)據(jù)源 ‘無子甌柑’和甌柑小孢子母細(xì)胞時(shí)期的花藥轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)源自課題組上傳的NCBI數(shù)據(jù)（NCBI登錄號(hào) PRJNA430695）。

1.1.2 材料 ‘無子甌柑’和甌柑采自浙江省麗水市富嶺街道南寨自然村，采樣時(shí)間參照前期研究［9］。采集 ‘無子甌柑’和甌柑成熟時(shí)期的花蕾進(jìn)行基因克隆。采集兩者小孢子母細(xì)胞時(shí)期（Ⅰ，花蕾直徑2.0～2.4 mm）、減數(shù)分裂時(shí)期（Ⅱ，花蕾直徑2.4～2.8 mm）和四分體時(shí)期（Ⅲ，花蕾直徑 2.8～3.1 mm）的花藥，用于分析不同發(fā)育時(shí)期的基因表達(dá)量。采集兩者成熟花粉粒時(shí)期花蕾（花蕾直徑6.5～6.9 mm）的4個(gè)不同部位（花藥、花絲、雌蕊和花瓣），用于分析不同部位的基因表達(dá)量。所有材料均保存于-80℃。

1.2 基因克隆和基因表達(dá)量分析

利用RNA提取試劑盒（TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit，TaKaRa）提取甌柑、 ‘無子甌柑’不同發(fā)育時(shí)期的花藥和成熟花粉粒時(shí)期花蕾不同部位的RNA，并對RNA樣品質(zhì)量進(jìn)行檢測。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser，TaKaRa）說明書，將得到的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并于-20℃保存。

以克里曼丁橘基因組數(shù)據(jù)庫為參考，對小孢子母細(xì)胞時(shí)期 ‘無子甌柑’和甌柑的花藥進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組分析，鑒定得到CHS基因家族成員；以差異表達(dá)倍數(shù)（FC）＞1.2，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）＜0.01為標(biāo)準(zhǔn)［10］，篩選到CHS同源差異表達(dá)基因；以差異表達(dá)倍數(shù)（FC）＞1.2，假設(shè)概率（P）＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)，篩選CHS同源差異表達(dá)蛋白。

對得到的差異表達(dá)CHS基因進(jìn)行克隆及定量引物設(shè)計(jì)。對 ‘無子甌柑’和甌柑的CHS基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)（CDS,Coding Sequence）進(jìn)行克隆。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR,Polymerase Chain Reaction）程序?yàn)?5℃，5 min；95℃，30 s，56℃，40 s，38個(gè)循環(huán)；72℃，10 min。PCR產(chǎn)物在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳。利用膠回收試劑盒（TaKaRa）純化膠回收產(chǎn)物并連接到pMD-18質(zhì)粒（TaKaRa），轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌Escherichia coliDH5α（TaKaRa）中，37℃震蕩培養(yǎng)后涂板挑菌。通過菌液PCR及電泳檢測后，選出條帶大小正確的菌液送生工生物工程（上海）有限公司測序，獲得基因的核苷酸序列。

以克里曼丁橘序列為模板，在線設(shè)計(jì)qRT-PCR特異性引物（https://www.genscript.com），以甜橙Citrus sinensis的Actin基因（GU911361）［9］為內(nèi)參基因，引物序列由生工生物工程（上海）有限公司合成。利用CFX96 real-time system實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Bio-Rad）及熒光染料SYBRPremix ExTaqTMⅡ（TaKaRa）說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，反應(yīng)程序?yàn)?5℃，30 s，95℃，5 s，57℃，30 s，39個(gè)循環(huán)，65～95℃升溫檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線［9］。設(shè)置3個(gè)重復(fù)，根據(jù)2-△△Ct方法，以甌柑小孢子母細(xì)胞時(shí)期花藥的表達(dá)量為基準(zhǔn)計(jì)算基因相對表達(dá)量［11］，比較 ‘無子甌柑’和甌柑在花藥不同發(fā)育時(shí)期和花粉粒成熟期花蕾不同部位的基因表達(dá)量。

1.3 CHS基因家族生物信息學(xué)分析

柑橘CHS基因編碼區(qū)核苷酸序列相似度極高［8］，因此以克里曼丁橘為例開展CHS基因及蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析。登錄克里曼丁橘數(shù)據(jù)庫，下載CHS基因全長序列、基因CDS序列、家族蛋白序列等信息。所有蛋白質(zhì)序列通過在線數(shù)據(jù)庫ExPASY（https://web.expasy.org/protparam）進(jìn)行蛋白生理生化分析?；谝延袌?bào)道［12］，利用CELLOv2.5進(jìn)行亞細(xì)胞定位。通過在線數(shù)據(jù)庫Prabi（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）進(jìn)行蛋白二級結(jié)構(gòu)分析。利用MEGA6.0軟件采用鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建克里曼丁橘（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Cclementina）、甜橙（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Csinensis）、擬南芥Arabidopsis thaliana（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Athaliana）和水稻Oryza satava（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Osatava）的CHS同源蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹，設(shè)置Bootstrap值為1000，去除支持率低于50%的節(jié)點(diǎn)，并顯示各分支長度。

表1 ‘無子甌柑’CHS基因家族成員及其小孢子母細(xì)胞時(shí)期相對表達(dá)量Table 1 CHS gene family and expression in C.suavissima ‘Seedless’ at microsporcyte

表2 基因克隆引物Table 2 Sequences of primer for gene cloning

2 結(jié)果與分析

2.1 CHS基因家族成員的鑒定和克隆

對小孢子母細(xì)胞時(shí)期的 ‘無子甌柑’和甌柑花藥轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)分析，共得到10個(gè)CHS同源基因（表1）；轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果滿足差異表達(dá)倍數(shù)＞1.2且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率＜0.01的有3個(gè)基因（Ciclev10005133m，Ciclev10001405m，Ciclev10030093m），蛋白質(zhì)組測序結(jié)果滿足差異表達(dá)倍數(shù)＞1.2且假設(shè)概率＜0.05標(biāo)準(zhǔn)的有1個(gè)基因（Ciclev10015535m）。得到的4個(gè)差異表達(dá)CHS基因引物序列如表2。qRT-PCR特異性引物序列如表3。

表3 qRT-PCR引物Table 3 Sequences of primer for real-time PCR

對克隆得到的 ‘無子甌柑’和甌柑的CHS同源基因序列（CsCHS）進(jìn)行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Ciclev10015535m，Ciclev10005133m和Ciclev10030093m在甌柑和 ‘無子甌柑’間存在核苷酸序列變異，但僅Ciclev10030093m在編碼氨基酸水平發(fā)生了改變（表4）。

表4 甌柑和 ‘無子甌柑’的CHS同源基因Table 4 Alignments of CsCHS nucleotide sequences between Citrus suavissima ‘Seedless’ and C.suavissima

2.2 CHS基因家族成員的表達(dá)分析

圖1表明：小孢子母細(xì)胞時(shí)期， ‘無子甌柑’與甌柑相比Ciclev10005133m，Ciclev10030093m和Ciclev10015535m顯著下調(diào)，Ciclev10001405m顯著上調(diào)；減數(shù)分裂時(shí)期，Ciclev10005133m，Ciclev10001405m和Ciclev10015535m顯著下調(diào)；四分體時(shí)期，Ciclev10001405m和Ciclev10030093m顯著下調(diào)，Ciclev10005133m顯著上調(diào)。

圖1 ‘無子甌柑’和甌柑CHS基因在花藥發(fā)育過程中的基因表達(dá)分析Figure 1 Expression level of anther in different development stages in C.suavissima ‘Seedless’ and C.suavissima

由圖2可知：成熟花粉粒時(shí)期， ‘無子甌柑’和甌柑的花絲中CHS基因表達(dá)量相仿。花藥中Ciclev10001405m和Ciclev10005133m表達(dá)量顯著高于其他花器官；Ciclev10030093m，Ciclev10005133m和Ciclev10015535m的表達(dá)在 ‘無子甌柑’和甌柑的花藥中存在顯著差異，可能會(huì)引起該時(shí)期 ‘無子甌柑’和甌柑的花藥中黃酮含量的差異?？偟膩碚f，花藥中Ciclev10001405m表達(dá)量遠(yuǎn)高于花瓣、雌蕊和花絲，推測Ciclev10001405m的表達(dá)在花藥中具有特異性。

圖2 ‘無子甌柑’和甌柑花蕾不同部位的CHS基因的相對表達(dá)量Figure 2 Expression of CHS genes among different floral organs in C.suavissima ‘seedless’ and C.suavissima

2.3 CHS基因家族的生物信息學(xué)分析

2.3.1CHS基因家族成員鑒定 克里曼丁橘基因組數(shù)據(jù)庫共鑒定到13個(gè)CHS基因家族成員。對CHS蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的分析表明：編碼的氨基酸數(shù)量最少的是Ciclev10003127m（309個(gè)），最多的是Ciclev10001395m（396個(gè)）；平均等電點(diǎn)為6.12，所有蛋白質(zhì)均為酸性蛋白。相比之下， ‘無子甌柑’和甌柑中，Ciclev10005133m（390個(gè)）編碼的氨基酸數(shù)量最少，Ciclev10001405m（395個(gè)）編碼的氨基酸數(shù)量最多；平均等電點(diǎn)為6.27（表5）。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明：這些CHS蛋白都分布在細(xì)胞質(zhì)中，說明CHS蛋白在細(xì)胞中的分布具有特異性。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析表明：α-螺旋比例和數(shù)量均最高，β-轉(zhuǎn)角則相對較少；表現(xiàn)為α-螺旋數(shù)量＞無規(guī)則卷曲數(shù)量＞延伸鏈數(shù)量＞β-轉(zhuǎn)角數(shù)量。 ‘無子甌柑’與甌柑中篩選的4個(gè)CHS蛋白也表現(xiàn)出相似趨勢（表6），推測α-螺旋在蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中起主導(dǎo)作用。

表5 CHS基因及其表達(dá)Table 5 Basic information of CHS genes and proteins

2.3.2 CHS家族同源蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 現(xiàn)有研究篩選到克里曼丁橘13個(gè)CHS蛋白、甜橙7個(gè)CHS蛋白、擬南芥4個(gè)CHS蛋白和水稻3個(gè)CHS蛋白。按照遺傳距離可以將CHS蛋白聚類為5個(gè)亞家族（圖3）。GroupⅠ包含3個(gè)擬南芥CHS蛋白和2個(gè)水稻CHS蛋白。GroupⅡ包含5個(gè)克里曼丁橘CHS蛋白和3個(gè)甜橙CHS蛋白。GroupⅢ包含2個(gè)克里曼丁橘CHS蛋白。GroupⅣ包含3個(gè)克里曼丁橘CHS蛋白和3個(gè)甜橙CHS蛋白。GroupⅤ包含上述4個(gè)物種的CHS蛋白成員。其中Ciclev10005133m蛋白和Ciclev10015535m蛋白均聚類于GroupⅤ，Ciclev10030093m蛋白和Ciclev10001405m蛋白則分別聚類于GroupⅡ和GroupⅣ。

表6 CHS蛋白二級結(jié)構(gòu)分析Table 6 Secondary structure analysis of CHS proteins

3 討論與結(jié)論

查爾酮合成酶（CHS）催化丙二酰-CoA和香豆酰-CoA結(jié)合形成查爾酮，是黃酮類化合物代謝通路（ko00941）中的第1個(gè)限速酶；查爾酮是各種黃酮類化合物的基本骨架，其數(shù)量異動(dòng)會(huì)影響黃酮類化合物的形成，進(jìn)而造成花藥顏色、形態(tài)異常［4-5］。一般認(rèn)為黃酮類化合物是柑橘具有高抗氧化性和良好藥用功效的原因［8］；矮牽牛CHS突變后花藥顏色由黃色變成白色，花藥功能異常，引起雄性不育［4］；枸杞CHS的下調(diào)表達(dá)會(huì)影響花藥功能，造成枸杞雄性不育［5］；水稻中CHS的過量表達(dá)會(huì)引起花藥表面色素大量沉淀，造成水稻雄性不育［13］。

圖3 4個(gè)物種CHS蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 3 Phyogenetic trees of CHS proteins from four species

CHS基因家族中成員不多，不同植物中數(shù)量也不同。如：擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫中僅鑒定到4個(gè)同源基因，大豆Glycine max［14］中略多（8 個(gè)）。 對已篩選的 CHS 同源基因的研究發(fā)現(xiàn)［13］：X89859.1基因與水稻絨氈層的發(fā)育極其緊密，而后者發(fā)育正常與否直接關(guān)系著花粉的育性［15］。本研究在CHS蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析中發(fā)現(xiàn)，柑橘CHS同源蛋白Ciclev10005133m和水稻CHS同源蛋白X89895.1聚類于Group V，推測兩者具有相似的功能。在 ‘無子甌柑’中，Ciclev10005133m同源基因在小孢子母細(xì)胞至減數(shù)分裂時(shí)期的表達(dá)顯著低于甌柑，因此，Ciclev10005133m同源基因的異常表達(dá)可能對 ‘無子甌柑’小孢子母細(xì)胞發(fā)育過程產(chǎn)生不利影響。此外，Ciclev10015535m和Ciclev10030093m同源基因的表達(dá)也在小孢子母細(xì)胞時(shí)期出現(xiàn)顯著下調(diào)，因此，CHS同源基因起始于小孢子母細(xì)胞時(shí)期的下調(diào)表達(dá)可能成為后期 ‘無子甌柑’小孢子敗育的重要原因。

本研究以克里曼丁橘數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，從 ‘無子甌柑’和甌柑的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)中篩選出4個(gè)CHS同源差異表達(dá)基因，其核苷酸序列在 ‘無子甌柑’和甌柑中的相似度達(dá)到98%，并且3個(gè)同源基因在 ‘無子甌柑’中表達(dá)的顯著下調(diào)起始于小孢子母細(xì)胞時(shí)期。CHS的異常表達(dá)可能是 ‘無子甌柑’小孢子發(fā)育異常從而造成雄性不育的原因。