王倩穎，常鵬杰，申亞梅，張 超，董 彬，時寶柱

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 風(fēng)景園林與建筑學(xué)院，浙江 杭州 311300；2.奈曼旗橋河國有母樹林經(jīng)營林場，內(nèi)蒙古 通遼 028300）

實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）是在普通PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)，具有靈敏度高、定量準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好及高通量等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)分析的相關(guān)研究中［1-2］。但在實(shí)驗(yàn)過程中，目的基因的表達(dá)結(jié)果經(jīng)常受RNA的提取質(zhì)量、反轉(zhuǎn)錄合成效率等的影響，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差［3］，因此需要引入內(nèi)參基因?qū)虮磉_(dá)結(jié)果進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化以消除背景誤差的影響［4］。理想的內(nèi)參基因是指在不同的組織，不同時期，不同環(huán)境條件下甚至是不同植物下皆可相對穩(wěn)定表達(dá)的基因。它們是構(gòu)成細(xì)胞的基本轉(zhuǎn)錄組成分，參與維持細(xì)胞的基本功能，且與要分析的目標(biāo)基因具有相似的表達(dá)水平［5］。但大量實(shí)驗(yàn)研究表明，許多內(nèi)參基因的轉(zhuǎn)錄水平會因?yàn)橹参锏陌l(fā)育階段或?qū)嶒?yàn)條件的不同而出現(xiàn)差異，這種差異會影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，甚至得出錯誤的結(jié)論［6-7］。因此，在進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)前，選擇合適的內(nèi)參基因變得尤為重要。景寧木蘭Magnolia sinostellata是木蘭科Magnoliaceae木蘭屬M(fèi)agnolia新種，落葉灌木，先花后葉，花色艷麗，花瓣數(shù)量9～18瓣，觀賞價值極高，分布于浙江南部地區(qū)海拔1000 m以上的區(qū)域，是浙江省特有種，屬于極度瀕危物種［8］。景寧木蘭性喜溫涼濕潤、水分充足的環(huán)境，但隨著全球氣候變暖，城市熱島效應(yīng)的加劇，高溫環(huán)境嚴(yán)重影響著植物的生長。目前對景寧木蘭的研究集中在花色和花芽分化的轉(zhuǎn)錄組分析上［9］，抗逆性研究鮮有報道。通常情況下，采用遮陽等措施來降低高溫對景寧木蘭的傷害，但植物自身的抗熱脅迫的遺傳特性才是起決定作用的因素。因此，研究景寧木蘭對高溫脅迫的抗逆機(jī)制，解析其響應(yīng)高溫的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，有針對性地發(fā)掘相關(guān)抗性基因，對景寧木蘭的保護(hù)、分子育種有積極的意義。目前，尚未見到基于qRT-PCR技術(shù)篩選景寧木蘭內(nèi)參基因的相關(guān)報道。因此，本研究以熱脅迫下景寧木蘭1年生實(shí)生苗的根、莖、葉組織為材料，選取13個內(nèi)參基因，利用實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)和geNorm，NormFinder和BestKeeper等3個表達(dá)分析軟件篩選熱脅迫下表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因，以期為景寧木蘭熱脅迫下相關(guān)目的基因的表達(dá)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

采用的植物材料為種植于浙江農(nóng)林大學(xué)苗圃內(nèi)景寧木蘭1年生實(shí)生苗。選取長勢一致，無病蟲害的植株16盆，分別置于2個人工氣候箱內(nèi)（POX-1000A-12H），氣候箱光合光子照度為800 μmol·m-2·s-1，濕度控制在75%～80%，溫度分別為25℃（對照）和40℃（高溫處理），光周期為12 h/12 h。分別在處理24和48 h時采取根、葉片和莖段，在液氮中速凍后于-80℃中保存，用于RNA的提取。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄cDNA的合成 將凍存的樣品在液氮中研磨成粉后，用RNAperp Pure Plant Kit（天根，北京）試劑提取材料的總RNA，通過質(zhì)量濃度為1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性， 紫外分光光度計來檢測 RNA 的純度［D（260）/D（280）=1.8～2.1， D（260）/D（230）＞1.8］及質(zhì)量濃度［終質(zhì)量濃度（mg·L-1）=D（260）×n×40。 其中， D（λ）為波長 λ 處的吸光度， n 為稀釋倍數(shù)］。 全長 cDNA 第 1條鏈的合成按照PrimeScriptTM RT Master Mix（Takara，大連）試劑說明書操作，將得到的cDNA在-20℃保存。

1.2.2 候選內(nèi)參基因及定量引物設(shè)計 從前期構(gòu)建的景寧木蘭轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中，選取13個功能基因作為候選內(nèi)參基因的熒光定量PCR引物。引物信息見表1。

表1 13個候選內(nèi)參基因和目的基因的引物序列Table 1 Primer sequences of the 13 candidate reference genes and target genes

1.2.3 內(nèi)參基因熒光定量PCR擴(kuò)增程序 將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA稀釋10倍，使用SYRB Premix Ex TapⅡ（Takara，大連）實(shí)時定量PCR試劑盒，在Light Cycler 480Ⅱ（Roche）實(shí)時定量PCR儀進(jìn)行定量分析。反應(yīng)體系為 SYRB Premix Ex Tap Ⅱ10.0 μL， cDNA 模板 2.0 μL， 上下游引物各 0.8 μL（10 μm·L-1）， 雙蒸水（ddH2O）6.4 μL，共20.0 μL體系。每個樣品3次重復(fù)，擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃預(yù)變性30 s，共40個循環(huán)，然后60～95℃持續(xù)15 s作為溶解曲線分析程序。

1.2.4 引物擴(kuò)增效率的計算 將12個樣品的cDNA等量混合作為模板，按照5倍梯度稀釋產(chǎn)物，共5個梯度進(jìn)行熒光定量PCR，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用公式E=（10-1/K-1）×100%計算得出內(nèi)參引物的擴(kuò)增效率。其中E為擴(kuò)增效率，K為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。R2=（總平方和-殘差平方和）/總平方和，總平方和為標(biāo)準(zhǔn)曲線中響應(yīng)濃度Ct的實(shí)際值與平方值的平方差之和，殘差平方和為相應(yīng)濃度下Ct的估計值與實(shí)際值的平方差之和［10］。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析和處理 利用geNorm，NormFinder和BestKeeper 3個軟件分析13個候選內(nèi)參基因在不同處理下不同組織中的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析，從而得到熱脅迫下景寧木蘭表達(dá)相對穩(wěn)定的內(nèi)參基因。其中，BestKeeper軟件直接通過計算Ct對每個候選內(nèi)參基因進(jìn)行分析；geNorm和NormFinder將Ct根據(jù)公式Q=ECtmin-Ctsample進(jìn)行轉(zhuǎn)化，式中E為擴(kuò)增效率，當(dāng)其接近100%時，默認(rèn)為2進(jìn)行計算［11］；Ctmin為該基因在所有組織中的最小Ct；Ctsample為該基因在各個組織中的Ct。

2 結(jié)果與分析

2.1 景寧木蘭RNA的質(zhì)量檢測

提取的RNA條帶清晰，沒有彌散片狀或條帶消失的現(xiàn)象，說明RNA完整性良好，且沒有降解。景寧木蘭RNA樣品的D（260）/D（230）皆約2.0，＞1.8，說明RNA純度較高，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。

2.2 景寧木蘭候選內(nèi)參基因引物特異性及擴(kuò)增效率檢測

將12個樣品的cDNA等量混合，按照10倍梯度稀釋產(chǎn)物作為模板，進(jìn)行普通PCR和定量PCR擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示：13個引物的產(chǎn)物只有單一條帶，無可見引物二聚體，且13個引物的溶解曲線都只有明顯的單一峰，說明引物的特異性良好。計算擴(kuò)增效率結(jié)果顯示：擴(kuò)增效率為97.36%～110.91%，UBC最高，GADPH最低，相關(guān)系數(shù)R2為0.990～0.999（表2）。符合qRT-PCR試驗(yàn)的要求。

表2 候選內(nèi)參基因擴(kuò)增特性Table 2 Candidate reference genes amplification specificity

2.3 景寧木蘭候選內(nèi)參基因表達(dá)水平分析

利用比較Ct的方法評估13個候選內(nèi)參基因在不同處理下平均表達(dá)水平（圖 1）。18S的Ct最小，為4.601，平均表達(dá)水平最高；余下12個候選內(nèi)參基因的Ct為15.869～23.072，表達(dá)水平相差不大。

圖1 候選內(nèi)參基因不同組織中的CtFigure 1 Candidate reference genes Ctvalues in different tissues

2.4 景寧木蘭候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析

geNorm軟件根據(jù)計算得到的平均表達(dá)穩(wěn)定指數(shù)M來進(jìn)行穩(wěn)定性排序，M越大表明基因越不穩(wěn)定，以M=1.5為標(biāo)準(zhǔn)，M＜1.5認(rèn)為是理想內(nèi)參基因的穩(wěn)定表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)。同時，該軟件還通過內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)化的配對差異分析（Vn/Vn+1）來得到內(nèi)參基因的合適數(shù)量，軟件默認(rèn)以Vn/Vn+1=0.15為標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)Vn/Vn+1＜0.15時，表明n個內(nèi)參基因已經(jīng)可以穩(wěn)定作為內(nèi)參基因，沒必要引入第n+1個基因［12］。通過圖2可知：13個基因的M為0.0500～0.2000，＜1.5，說明13個候選內(nèi)參基因都達(dá)到了作為內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)，其中ACTIN-7和EF-1α最為穩(wěn)定，M=0.33449。GADPH的M最大，為1.14166，是所有候選內(nèi)參基因中表達(dá)最不穩(wěn)定的。圖3表明：V2/V3為0.021＜0.15，說明2個基因可穩(wěn)定作為內(nèi)參基因，結(jié)果可靠，無需引入第3個基因。進(jìn)一步分析表明：ACTIN-7和EF-1α為最佳內(nèi)參組合。

BestKeeper軟件通過計算內(nèi)參基因Ct的標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）對內(nèi)參基因的的穩(wěn)定性進(jìn)行排序，標(biāo)準(zhǔn)偏差越小表明內(nèi)參基因的穩(wěn)定性越好，如果標(biāo)準(zhǔn)偏差＞1，則認(rèn)為該基因不穩(wěn)定［8］。表3顯示：在不同組織中，NADP和GADPH的標(biāo)準(zhǔn)偏差大于1，說明這2個基因表達(dá)不穩(wěn)定。余下的11個內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)偏差皆小于1，其中UBC，EF-1α，ACTIN-7和GTB穩(wěn)定性最好，排名最高。

NormFinder軟件通過計算組內(nèi)和組間的方差得到表達(dá)穩(wěn)定值，并對候選內(nèi)參基因進(jìn)行排序，穩(wěn)定值越小，表明內(nèi)參基因越穩(wěn)定。表3顯示：UBQ，EF-1α和TEF分別排在前3位，表達(dá)穩(wěn)定值較為接近，表達(dá)最為穩(wěn)定；CYP的穩(wěn)定值最大，為0.237，表達(dá)穩(wěn)定性最差。

圖2 geNorm軟件分析內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定值Figure 2 Reference genes expression stability by geNorm

圖3 geNorm軟件分析內(nèi)參基因配對變異值Figure 3 Reference genes pairwise variation value by geNorm

表3 BestKeeper和NormFinder軟件分析內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性及排名Table 3 Reference genes expression stability and ranking by BestKeeper and NormFinder

2.5 景寧木蘭候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性驗(yàn)證

綜合以上3個軟件分析的結(jié)果，本研究選擇了穩(wěn)定性較好的3個基因（UBC，EF-1α和ACTIN-7）和1個基因組合（EF-1α和ACTIN-7）。通過分析CSLD3和KOR基因在景寧木蘭不同組織的表達(dá)模式來進(jìn)一步驗(yàn)證篩選的候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。CSLD3是植物合成根毛細(xì)胞壁的重要纖維素合成酶基因，可以引起細(xì)胞壁形成的缺陷［13］。研究表明此基因在根部中表達(dá)最高［14］。KOR基因是植物合成細(xì)胞壁中發(fā)揮重要作用的纖維素合成酶基因，在莖中和木質(zhì)部中表達(dá)量最高［6,15］。對3個內(nèi)參基因進(jìn)行相對表達(dá)量量化（圖4），CSLD3在根中表達(dá)最高，KOR在莖中表達(dá)最高。以EF-1α和ACTIN-7內(nèi)參基因組合標(biāo)準(zhǔn)化，目的基因也顯示出一致的表達(dá)水平，進(jìn)一步表明了這3個內(nèi)參基因的可靠性。

3 討論

SPIEGELAERE等［16］研究認(rèn)為軟件間的算法和判斷標(biāo)準(zhǔn)不同導(dǎo)致結(jié)果的差異，因此在評估內(nèi)參基因時應(yīng)先綜合分析各軟件的結(jié)果，再進(jìn)行比較排序，最終篩選出最適宜的內(nèi)參基因。理想的內(nèi)參基因應(yīng)在各種類型的組織、細(xì)胞和各種實(shí)驗(yàn)因素條件下均恒定表達(dá)［17-18］。但大量實(shí)驗(yàn)表明：內(nèi)參基因只是在一定的范圍內(nèi)可以穩(wěn)定表達(dá)，在特定的實(shí)驗(yàn)條件下，應(yīng)該篩選特定的內(nèi)參基因來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)［19］。因此，本研究選擇了景寧木蘭在熱脅迫下的根、莖、葉組織進(jìn)行內(nèi)參基因的篩選研究。得到UBC，EF-1α和ACTIN-7為熱脅迫下不同組織的最佳內(nèi)參基因，這3個內(nèi)參基因均是傳統(tǒng)內(nèi)參基因，其中UBC基因是泛素蛋白翻譯后修飾的的基因，參與細(xì)胞多種調(diào)控過程，如細(xì)胞周期，細(xì)胞的增值與分化，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等［20］，在桂花Osmanthus fragrans花芽的不同發(fā)展階段［21］、 桉樹Eucalyptus robusta不同組織［22］中均表達(dá)穩(wěn)定；ACTIN是細(xì)胞的骨架成分，幾乎在所有的真核細(xì)胞中均有表達(dá)［23］，在楊樹Populus tomentosa不同光周期和低溫條件下的莖尖、幼葉、成熟葉和樹皮組織中、油菜Brassica campestris的營養(yǎng)組織中以及番茄Lycopersicon esculentum的葉子和根組織中也表現(xiàn)出最佳的穩(wěn)定性［24-26］。EF-1α是一種重要的多功能蛋白，參與細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)、翻譯控制、骨架組成等多種重要的細(xì)胞學(xué)過程［27］。ACTIN和EF-1α在毛果楊Populustrichocarpa不同組織為材料［11］和梧桐Firmiana platanifolia種子的不同發(fā)育階段［28］中均表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性。SILVEIRA等［29］在一種重要牧草珊狀臂形草Brachiaria brizantha的內(nèi)參基因篩選中同樣得到EF-1α穩(wěn)定性最佳的結(jié)果。

圖4 CSLD3和KOR在景寧木蘭不同組織中的表達(dá)分析Figure 4 Expression of CSLD3 and KOR in different tissues of Magnolia sinostellata

理想的內(nèi)參基因的表達(dá)水平應(yīng)是適中的，不宜過高，也不宜過低，Ct應(yīng)為15～30［30］。本研究中18SrRNA基因的Ct遠(yuǎn)低于15，表達(dá)豐度過高，影響其穩(wěn)定性，不適宜作為內(nèi)參基因。在光皮樺Betula luminifera的根、莖、葉和種子等不同組織中也出現(xiàn)了18S的Ct過低的情況［10］。在牡丹Paeonia suffruticosa不同組織不同花期［31］以及水稻Oryza sativa受到稻縱卷葉螟Chaphalocrocis medinalis蟲害誘導(dǎo)后內(nèi)參基因研究［32］中也得到了相同結(jié)果。而周良云等［33］對黃花嵩Artemisia annua進(jìn)行不同濃度的鎘處理，最終選取了ACTIN-7，18S和PAL為內(nèi)參基因來校正目的基因的表達(dá)量；蘇曉娟等［11］也發(fā)現(xiàn)毛果楊在鋅脅迫下18SrRNA穩(wěn)定性較好，可用作內(nèi)參基因。進(jìn)一步表明了不同植物在不同條件下，內(nèi)參基因穩(wěn)定性差異較大。

研究中選擇2個或2個以上的基因可以有效增加結(jié)果的可靠度及精確度，以此來減弱單一內(nèi)參基因可能造成的結(jié)果偏差［17］。劉文哲等［10］在光皮樺中通過目的基因的表達(dá)分析驗(yàn)證內(nèi)參基因的可靠性，結(jié)果顯示了3個內(nèi)參基因及其組合對目的基因定量標(biāo)準(zhǔn)化差異較小。PARK等［34］在不同品種甘薯Dioscorea esculenta的非生物脅迫條件下，使用單個穩(wěn)定的內(nèi)參基因ARF和最佳內(nèi)參基因組合（ARF/COX）對2個目的基因IbLEA14和swpa2進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證，結(jié)果也顯示了單個內(nèi)參基因和組合驗(yàn)證對目的基因表達(dá)水平的校準(zhǔn)結(jié)果基本一致。本研究以EF-1α和ACTIN-7為組合內(nèi)參基因進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)單個內(nèi)參EF-1α與其有微小差異，2個基因組合可使基因定量結(jié)果更加準(zhǔn)確。但是與單個基因做內(nèi)參相比，2個或2個以上的基因做內(nèi)參需要增加更多的樣本量和耗費(fèi)大量成本，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果并無明顯差異。因此，在實(shí)驗(yàn)過程中可綜合考慮后再進(jìn)行選擇。