王千千，蔣琦妮，付建新，董 彬，趙宏波

（浙江農(nóng)林大學(xué) 風(fēng)景園林與建筑學(xué)院，浙江 杭州，311300）

桂花Osmanthus fragrans是中國十大傳統(tǒng)名花之一，深受人們喜愛。不同學(xué)者已經(jīng)從桂花的花芽分化［1-3］、 開花機(jī)制［4-5］、 花色呈現(xiàn)［6-7］、 花香釋放［8-9］等不同層面展開了研究。 隨著分子水平研究的不斷深入，利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）分析基因的表達(dá)已成為研究這些過程機(jī)理的重要手段，而篩選得到適合不同研究的內(nèi)參基因格外重要。研究認(rèn)為［10-11］，內(nèi)參基因并不存在通用性，不同處理、不同組織中內(nèi)參基因的表達(dá)水平都會(huì)發(fā)生改變［12］；選用一種內(nèi)參基因無法準(zhǔn)確反映不同植物組織、同一組織不同處理下的基因表達(dá)水平［13-14］。因此，根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)材料和處理?xiàng)l件篩選合適的內(nèi)參基因十分必要［15］。光周期和溫度處理能對桂花的基因表達(dá)水平、花芽分化進(jìn)程等產(chǎn)生影響。研究表明［4，16］：長日照和相對低溫都能夠加快桂花花芽分化進(jìn)程，而短日照條件下桂花的花芽分化相對較慢，低溫或高溫都會(huì)抑制桂花的花芽分化。本研究在不同光周期和溫度條件下對桂花常用的7個(gè)候選內(nèi)參基因進(jìn)行比較分析，篩選最佳內(nèi)參基因，為后期研究光周期和溫度影響桂花開花的機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料為多年生 ‘佛頂珠’O.fragrans‘Foding Zhu’盆栽植株，種植于浙江農(nóng)林大學(xué)桂花資源圃。設(shè)置4個(gè)處理：長日照高溫（光照/黑暗=14 h/10 h，26℃），長日照低溫（光照/黑暗=14 h/10 h，19℃），短日照高溫（光照/黑暗=10 h/14 h，26℃）和短日照低溫（光照/黑暗=10 h/14 h，19℃），光照強(qiáng)度為100%，相對濕度為60%～80%。實(shí)驗(yàn)材料在上述環(huán)境中培養(yǎng)40 d。處理結(jié)束后從8:00起，每隔4 h取當(dāng)年生枝條的第2片或第3片嫩葉，液氮速凍，放于-80℃保存。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA的合成 每樣品取50～100 mg，充分研磨后按照RNAprep pure Plant Kit（天根，北京）說明書步驟提取各樣品RNA。通過紫外分光光度計(jì)和質(zhì)量濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測所提RNA濃度和品質(zhì)。以所提樣品RNA為模板，按照Reverse Transcriptase M-MLV（Takara，大連）說明書合成cDNA第1條鏈，合成后于-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 候選內(nèi)參基因的選擇和特異性引物設(shè)計(jì) 從桂花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中選擇肌動(dòng)蛋白基因（OfACT）、延伸因子1α蛋白基因（OfEF1α）、NADP-異檸檬酸脫氫酶基因（OfIDH）、GTP結(jié)合蛋白R(shí)NA1基因（OfRNA1）、β 微管蛋白基因（OfTUB）、 泛素結(jié)合酶 E2 基因（OfUBC2）和 18S 核糖體 RNA 基因（Of18S）［12，17］等7個(gè)使用較多的內(nèi)參基因作為候選內(nèi)參基因。采用SYBR greenⅡ熒光染料嵌合法進(jìn)行內(nèi)參基因的篩選，設(shè)計(jì)候選內(nèi)參基因的引物，通過Bioxman和Primer Premier 5軟件對引物進(jìn)行校驗(yàn)，并利用Primer-BLAST進(jìn)行檢測以確認(rèn)引物序列的特異性。選用的引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成（表1）。

1.2.3 熒光定量PCR分析 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)方法參考SYBRPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）（Takara，大連）試劑盒。采用20.0 μL的反應(yīng)體系：其中雙蒸水 6.4 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA模板2.0 μL，SYBRⅡ熒光染料10.0 μL。反應(yīng)在ABI 7300實(shí)時(shí)PCR儀中進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃下預(yù)變性30 s；95℃下反應(yīng) 5 s，60℃反應(yīng) 31 s，共40個(gè)循環(huán)；95℃下反應(yīng)15 s，60℃下反應(yīng) 1 min，95℃下反應(yīng)30 s， 60 ℃下反應(yīng) 15 s［17］。 3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 用geNorm，NormFinder和BestKeeper軟件分別對qRT-PCR中所得到樣品的反應(yīng)循環(huán)數(shù)（Ct值）進(jìn)行分析，比較7個(gè)候選內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性，并選擇最佳內(nèi)參基因。geNorm軟件以各候選內(nèi)參基因在樣品中的表達(dá)水平為依據(jù)，計(jì)算各候選基因的表達(dá)穩(wěn)定性（M），M值越小越穩(wěn)定；M＜1.5時(shí)認(rèn)為是理想內(nèi)參［18-19］。geNorm軟件還可以根據(jù)候選內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)化因子的配對差異性分析（Vn/Vn+1）得出最佳內(nèi)參基因的個(gè)數(shù)；其中V表示配對差異值，n表示內(nèi)參基因個(gè)數(shù)。軟件默認(rèn)的（Vn/Vn+1）值為0.15，當(dāng)Vn/Vn＋1＜0.15時(shí)，表明引入的n個(gè)內(nèi)參基因已經(jīng)穩(wěn)定，不需要引入（n＋1）內(nèi)參基因，當(dāng)Vn/Vn＋1＞0.15時(shí)，則需要引入（n＋1）個(gè)內(nèi)參基因［17，20］。因geNorm軟件最終挑選出2個(gè)或2個(gè)以上的內(nèi)參基因組合來校正數(shù)據(jù)，所以n≥2。為了了解引用1個(gè)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，需要通過NormFinder和BestKeeper軟件做進(jìn)一步分析。NormFinder軟件對內(nèi)參基因的篩選是基于方差分析的結(jié)果，利用△Ct法計(jì)算候選內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定值（S），從而評估候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性；S越小，基因越穩(wěn)定［21］。BestKeeper軟件通過計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）對候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評價(jià)和排序，SD越小，則該基因的穩(wěn)定性越好；若SD＞1，則認(rèn)為該基因不穩(wěn)定［20-21］。最后通過晝夜節(jié)律基因GI的相對表達(dá)水平，對選擇的最佳內(nèi)參基因進(jìn)行驗(yàn)證。

表1 qRT-PCR相關(guān)內(nèi)參基因引物信息Table 1 List of primers for qRT-PCR

2 結(jié)果和分析

2.1 RNA品質(zhì)及引物擴(kuò)增效率檢測

提取不同處理桂花樣品的總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測，所有樣品總RNA的吸光度值［D（260）/D（280）和D（260）/D（230）］均為1.8～2.1。將所有樣品的cDNA等量混合后作為模板，進(jìn)行普通PCR和定量PCR檢測。為檢測引物的擴(kuò)增效率，設(shè)置6個(gè)cDNA濃度梯度（原液，5-1，5-2，5-3，5-4，5-5原液），根據(jù)qRT-PCR結(jié)果，利用公式E=（10-1/s-1）×100%得出基因的擴(kuò)增效率（表2），其中：E（%）表示擴(kuò)增效率，s表示曲線斜率。經(jīng)計(jì)算，擴(kuò)增效率為95%～110%，相關(guān)系數(shù)為0.993～0.998，符合qRT-PCR的基本要求。

2.2 候選內(nèi)參基因的轉(zhuǎn)錄水平分析

根據(jù)擴(kuò)增效率，將各樣品的原始cDNA稀釋50倍后作為模板進(jìn)行qRT-PCR。通過比較循環(huán)數(shù)（Ct）來評估各候選內(nèi)參基因在所有樣品中的轉(zhuǎn)錄水平（表2），候選內(nèi)參基因平均Ct為8.99～28.44，其中Of18S的Ct最小，說明平均表達(dá)水平最高；OfTUB最大，說明平均表達(dá)水平最低；其他候選內(nèi)參基因平均表達(dá)水平差異則相對較小。

2.3 內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析

geNorm軟件分析發(fā)現(xiàn)（表3），所有候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定值均小于1.5，符合內(nèi)參基因篩選的標(biāo)準(zhǔn)；其中OfRAN1和OfIDH的穩(wěn)定值相等且最?。∕=0.347），在不同樣品中表達(dá)最為穩(wěn)定，其次是OfACT基因（M=0.393），Of18S穩(wěn)定值最大（M=0.601），說明Of18S表達(dá)穩(wěn)定性最差。對候選內(nèi)參基因的配對差異值測算可知（圖1）：V2/3=0.126＜0.15，表明引入2個(gè)內(nèi)參基因已經(jīng)穩(wěn)定，無需引入更多的內(nèi)參基因。geNorm軟件分析結(jié)果表明，最佳候選內(nèi)參基因?yàn)镺fRAN1和OfIDH。

表2 7個(gè)候選內(nèi)參基因擴(kuò)增參數(shù)Table 2 Amplification parameters of seven candidate reference genes

NormFinder軟件分析發(fā)現(xiàn)，OfRAN1基因的表達(dá)穩(wěn)定性最高，其次是OfIDH，Of18S基因表達(dá)穩(wěn)定最差，與geNorm軟件分析的結(jié)果一致（表3）。BestKeeper軟件的分析結(jié)果顯示（表3），在7個(gè)候選內(nèi)參基因中，OfIDH基因的表達(dá)穩(wěn)定性最高，其次是OfRAN1，Of18S基因的表達(dá)穩(wěn)定性最差。分析結(jié)果盡管與geNorm和NormFinder軟件的結(jié)果有些差異，但最佳候選內(nèi)參基因結(jié)果一致。

表3 不同軟件分析7個(gè)候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性Table 3 Gene expression stability of seven reference genes by different software

綜合3個(gè)軟件的分析結(jié)果可以得出，不同處理?xiàng)l件下，OfRAN1和OfIDH的表達(dá)穩(wěn)定性均為最高，可作為最佳內(nèi)參基因，而Of18S是表達(dá)穩(wěn)定性最差的基因。

圖1 geNorm軟件分析候選內(nèi)參基因的配對差異值Figure 1 Pairwise variationof candidate reference genes as calculated by geNorm

2.4 桂花GI基因?qū)ψ罴褍?nèi)參基因穩(wěn)定性的驗(yàn)證

GIGANTEA基因（GI）是光周期途徑的重要調(diào)控基因，其表達(dá)呈現(xiàn)明顯的晝夜節(jié)律。選用桂花晝夜節(jié)律相關(guān)基因GI對候選內(nèi)參基因進(jìn)行驗(yàn)證，可提高內(nèi)參基因篩選的準(zhǔn)確性，保證最佳內(nèi)參基因?qū)庵芷谕緩交虮磉_(dá)水平的校準(zhǔn)作用。選擇OfRAN1/OfIDH，OfRAN1，OfIDH以及其他候選內(nèi)參基因?qū)I基因的相對表達(dá)水平進(jìn)行校準(zhǔn)（圖2），結(jié)果顯示：相比其他內(nèi)參基因，不同處理下OfRAN1/OfIDH校準(zhǔn)的GI基因的表達(dá)模式表現(xiàn)為光照條件下積累，黑暗條件下降低的周期性表達(dá)，符合GI基因的晝夜表達(dá)規(guī)律。說明3個(gè)內(nèi)參基因篩選軟件對候選內(nèi)參基因篩選的結(jié)果是正確的，即OfRAN1和OfIDH基因可作為桂花不同光周期和溫度處理的最佳內(nèi)參基因。

3 討論

熒光定量PCR因其眾多優(yōu)點(diǎn)被廣泛運(yùn)用于基因表達(dá)的研究中，成為量化基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，揭示基因表達(dá)規(guī)律的有效方法［22-23］；但引用適當(dāng)?shù)膬?nèi)參基因?qū)RT-PCR的結(jié)果進(jìn)行校準(zhǔn)是非常必要的［20］。理想內(nèi)參基因在不同組織、不同發(fā)育階段、不同生長條件下均能穩(wěn)定表達(dá)［17，24］，但事實(shí)上并沒有哪一個(gè)基因能夠滿足所有條件［25］。因此，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)材料和處理?xiàng)l件，篩選出合適的、特定的內(nèi)參基因是確保實(shí)驗(yàn)成功的必要條件。

圖2 不同內(nèi)參基因或組合校正桂花不同條件下GI基因的相對表達(dá)Figure 2 Relative expression levels of GI in different conditions using different reference genes or reference gene combination for normalization

研究發(fā)現(xiàn)［26］：選用2個(gè)或更多內(nèi)參基因組合可以提高內(nèi)參基因校準(zhǔn)的精確度，弱化單一內(nèi)參基因帶來的不準(zhǔn)確性。RAN（ras-related nuclear protein）是小G蛋白的一類，在細(xì)胞生理進(jìn)化中起到重要的作用，它的很多同源基因是不同光周期、溫度條件下常用的內(nèi)參基因［12，17］。IDH的同源基因被證實(shí)為不同溫度條件下桉樹Eucalyptus robusta的最佳內(nèi)參基因［27］；ACT和18S同源基因分別可作為不同光周期［28］、溫度條件［29］下大豆Glycine max的內(nèi)參基因；EF1a和TUB基因可作為不同光周期、溫度條件下玉米Zea mays的內(nèi)參基因［30］；UBC2的同源基因可作為不同溫度條件下歐芹Petroselinum crispum的內(nèi)參基因［31］。本研究選用了桂花中常用的7個(gè)候選內(nèi)參基因，對其在不同光周期和溫度處理下嫩葉中的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行研究；利用geNorm，NormFinder和BestKeeper等3個(gè)常用于內(nèi)參基因篩選的軟件進(jìn)行評估，發(fā)現(xiàn)這7個(gè)候選內(nèi)參基因在所有樣品中表達(dá)穩(wěn)定性的排序基本相同，均顯示OfRAN1和OfIDH基因是最穩(wěn)定的2個(gè)內(nèi)參基因，將兩者進(jìn)行組合可以準(zhǔn)確的校準(zhǔn)不同處理下桂花葉片中目的基因的表達(dá)水平；而Of18S表達(dá)最不穩(wěn)定，在所有實(shí)驗(yàn)材料中都存在較高的表達(dá)豐度，因而不適合作為本研究的內(nèi)參基因。

光周期和溫度途徑在調(diào)控植物成花過程中發(fā)揮重要作用。篩選得到的桂花不同光周期和溫度條件下的內(nèi)參基因，能夠?yàn)檠芯抗鸹ㄔ诓煌瑴囟群凸庵芷谔幚項(xiàng)l件下的成花機(jī)制提供參考依據(jù)，為了解相關(guān)成花基因表達(dá)模式提供保障。