王世博，張金蘭，李平蘭*

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是生物體有氧呼吸的副產(chǎn)物[1]，包括含氧自由基、氧離子和過氧化物[2]。在生物體內(nèi)，最主要的ROS來源是線粒體呼吸鏈產(chǎn)生的超氧陰離子[3-4]。ROS具有較強(qiáng)的化學(xué)活性[5]，在生物體內(nèi)積累的ROS能夠造成DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的氧化損傷，導(dǎo)致細(xì)胞和組織受損[6]，造成氧化壓力，促進(jìn)慢性疾病的發(fā)展，如動脈粥樣硬化、糖尿病、心臟病等[7-10]。

抗氧化肽正在逐漸作為食品成分被接受。在功能性食品和營養(yǎng)品中補(bǔ)充抗氧化肽，可以緩解人體內(nèi)的氧化應(yīng)激，降低氧化壓力[11]。目前，研究人員在乳制品和發(fā)酵乳中均發(fā)現(xiàn)了具有抗氧化能力的生物活性肽：劉志東等[12]在牛乳中發(fā)現(xiàn)抗氧化活性肽HIR；Mao Xueying等[13]發(fā)現(xiàn)，通過蛋白酶將牦牛乳酪蛋白降解為肽，可以表現(xiàn)出較強(qiáng)的自由基清除活性；Li等[14]在山羊乳酪蛋白酶解物中分離出5 種具有抗氧化活性的寡肽（VYPF、FGGMAH、FPYCAP、YVPEPF、YPPYETY）；Piovesana等[15]在驢乳中篩選出抗氧化肽TKTEEGEFISEGGGVR；Chang等[16]在發(fā)酵乳制品中分離出2 種抗氧化肽（VLSLSQSKVLPVPQK和VLSLSQSKVLPVPQKAVPYPQRDMPIQA）。這些乳制品中的抗氧化肽一些來自于乳中酪蛋白的水解，一些由發(fā)酵過程中的微生物產(chǎn)生。

已有研究表明，動物雙歧桿菌可以表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力[17-18]。動物雙歧桿菌乳亞種B013（Bifidobacterium animalissubsp. lactisB013）由本實(shí)驗(yàn)室分離自廣西巴馬長壽老人腸道，前期工作表明，該菌株有較強(qiáng)的抗氧化活性，同時菌株培養(yǎng)物上清液表現(xiàn)出較強(qiáng)的自由基清除能力[19]。本研究的目的是從菌株的培養(yǎng)物上清液中分離純化抗氧化活性物質(zhì)，并對活性物質(zhì)進(jìn)行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：動物雙歧桿菌乳亞種B013（Bifidobacterium animalissubsp. lactisB013）由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用微生物研究室保藏。

MRS肉湯培養(yǎng)基（生化試劑） 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；抗氧化劑檢測試劑盒、β-葡萄糖苷酶、纖維素酶 美國Sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)基 美國Corning公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.01 mol/L，pH 7.2～7.4） 北京酷來搏科技有限公司；氯化鈉、葡萄糖（均為分析純）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑（北京）有限公司；乙腈（色譜純） 美國Thermo Fisher公司；三氟乙酸（分析純） 上海麥克林生化科技有限公司；蛋白酶K 天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-LS-SⅡ全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌器上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；SCL-1300垂直流潔凈工作臺 北京賽伯樂實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；GB303電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Legend Micro 17臺式高速離心機(jī)、Q Exactive串聯(lián)質(zhì)譜儀美國Thermo Scientific公司；MQD-S3R恒溫培養(yǎng)箱上海晏泉儀器有限公司；Synergy HT多功能酶標(biāo)儀 美國BioTek公司；TM-100恒溫混勻儀 合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司；LNG-T98冷凍離心濃縮干燥器 太倉市華美生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 抗氧化能力測定

參照Rizzello[20]、G?kbulut[21]等的方法，使用抗氧化劑檢測試劑盒進(jìn)行測定。反應(yīng)體系中加入10 μL樣品和20 μL肌紅蛋白工作液，再加入150 μL 2,2’-聯(lián)氮雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azinobis-（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）ammonium salt，ABTS）工作液，反應(yīng)5 min，加入100 μL停止液（1 g/100 mL十二烷基硫酸鈉水溶液），測定405 nm波長處的吸光度（A405nm）。分別采用濃度為0、0.015、0.045、0.105、0.210、0.420 mmol/L的Trolox（水溶性VE，6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸，C14H18O4）溶液作為樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過將樣品的A405nm帶入回歸方程將樣品的抗氧化能力換算成Trolox當(dāng)量抗氧化能力（mmol Trolox/L）。

1.3.2 抗氧化活性培養(yǎng)物上清液培養(yǎng)體系的選擇

分別取培養(yǎng)24 h的動物雙歧桿菌乳亞種B013菌液1 mL，10 000 r/min離心2 min；棄去上清，用生理鹽水洗滌3 次去除殘余的培養(yǎng)基，分別加入1 mL DMEM培養(yǎng)液、1 mL含1 g/100 mL葡萄糖（pH 7.2～7.4）的0.01 mol/L PBS、1 mL含1 g/100 mL葡萄糖的生理鹽水和1 mL 1 g/100 mL的葡萄糖水溶液，反復(fù)振蕩，制成600 nm波長處光密度（optical density，OD600nm）為0.5的菌懸液；置于厭氧培養(yǎng)盒中，加入?yún)捬醍a(chǎn)氣袋，37 ℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束后10 000 r/min離心2 min，棄去沉淀保留上清，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.3.3 抗氧化活性培養(yǎng)物上清液培養(yǎng)體系響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

參照孫鵬等[22]的方法，進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)[23]。選取的因素和水平分別為：菌量（以O(shè)D600nm表示）：0.25、0.50、0.75；培養(yǎng)時間：24、18、12 h；葡萄糖添加量：1%、3%、5%。以上清液的總抗氧化能力作為響應(yīng)值。達(dá)到培養(yǎng)時間后，10 000 r/min離心2 min，棄去沉淀保留上清，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.3.4 抗氧化活性成分分析

按照響應(yīng)面優(yōu)化得到的培養(yǎng)體系制備活菌培養(yǎng)物上清液，進(jìn)行如下處理[24-25]：取1 mL培養(yǎng)物上清液，不進(jìn)行其他處理，作為對照組備用；取1 mL培養(yǎng)物上清液，100 ℃水浴5 min，冷卻至室溫備用；取1 mL培養(yǎng)物上清液，加入10 μL蛋白酶K溶液，37 ℃處理30 min；取1 mL培養(yǎng)物上清液，加入10 μLβ-葡萄糖苷酶和10 μL纖維素酶，50 ℃處理4 h；最后分別測定每個處理組的總抗氧化活性。

1.3.5 培養(yǎng)物上清液中肽粗品的制備

按照響應(yīng)面優(yōu)化得到的培養(yǎng)體系制備培養(yǎng)物上清液100 mL，10 000 r/min離心2 min，棄去沉淀保留上清，-20 ℃冷凍24 h，真空凍干48 h，加入10 mL去離子水，反復(fù)振蕩使凍干樣品溶解，將樣品放入透析袋中，4 ℃透析6 h，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.3.6 固相萃取

使用C18固相萃取小柱（容量6 mL，柱床容量500 mg），首先向小柱中加入純乙腈活化柱床；待乙腈流盡后加入含0.1%三氟乙酸（tri fluoroacetic acid，TFA）的超純水平衡柱床；取5 mL肽粗品加入5 μL TFA混勻，加入小柱；待樣品流盡后加入含0.1% TFA的超純水洗滌柱床，并重復(fù)2 次；依次用0%、20%、40%、60%、80%乙腈水溶液沖洗柱床，收集流出液，并分別測定抗氧化活性。

1.3.7 超濾

取固相萃取后抗氧化活性最高的組分進(jìn)行超濾。超濾管規(guī)格為3 kDa、15 mL，每次超濾10 000 r/min離心15 min。取第1次濾下的組分收集，作為樣品中分子質(zhì)量＜3 kDa的組分，未濾下的組分加入超純水補(bǔ)至原體積，再次進(jìn)行超濾并重復(fù)2 次，收集未濾下的部分，補(bǔ)超純水至原體積并收集，作為樣品中分子質(zhì)量＞3 kDa的組分。分別測定2 個組分的總抗氧化活性。

1.3.8 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析

使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析[26]，色譜分離時間90 min，流動相A為2%乙腈（加入0.1% TFA），流動相B為80%乙腈（加入0.1% TFA），流動相梯度洗脫程序如表1所示。

表 1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Mobile phase gradient elution procedure

質(zhì)譜掃描范圍（m/z）為350～1 300，采集模式為數(shù)據(jù)依賴采集（data-dependent acquisition，DDA）模式；選擇母離子中信號最強(qiáng)的20 個進(jìn)行二級碎裂；一級質(zhì)譜分辨率為70 000，碎裂方式為高能誘導(dǎo)裂解（higherenergy collisional dissociation，HCD）；二級分辨率為17 500，動態(tài)排除時間為18 s。對于質(zhì)譜得到的數(shù)據(jù)使用軟件PEAKS Studio 8.5進(jìn)行查庫，查庫時將raw文件提交至PEAKS Studio 8.5服務(wù)器，選擇已經(jīng)建立好的數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索。

1.3.9 抗氧化活性肽的預(yù)測與驗(yàn)證

通過生物活性肽數(shù)據(jù)庫BIOPEP檢索抗氧化肽的數(shù)據(jù)，使用基本局部相似性比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST），與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析得到的動物雙歧桿菌乳亞種B013培養(yǎng)物上清液中的肽序列進(jìn)行序列比對，篩選可能的抗氧化肽。對于篩選出的肽，使用在線折疊軟件PEP-FOLD 3.5[27]和BIOVIA Discovery Studio 2.5軟件進(jìn)行分子動力學(xué)模擬，得到肽分子的計(jì)算機(jī)模擬構(gòu)象。按照肽序列人工合成實(shí)驗(yàn)推測的抗氧化肽，驗(yàn)證其抗氧化活性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2016、R3.5.2、IBM SPSS Statistics 21、Origin 9.0、Design-Expert 8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗氧化活性測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過抗氧化劑檢測試劑盒測得的Trolox濃度與A405nm的線性回歸方程為y=-2.667 9x+1.581 3（R2=0.994 9）。

2.2 抗氧化活性培養(yǎng)物上清液培養(yǎng)體系的選擇

圖 1 不同培養(yǎng)體系得到的培養(yǎng)物上清液的總抗氧化活性Fig. 1 Total antioxidant activity of culture supernatants obtained from different culture systems

由圖1可知，培養(yǎng)體系為生理鹽水+葡萄糖時，培養(yǎng)物上清液的總抗氧化活性顯著高于其他培養(yǎng)體系，因此在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中對此體系進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步提高培養(yǎng)物上清液的抗氧化活性。

2.3 抗氧化活性培養(yǎng)物上清液培養(yǎng)體系響應(yīng)面優(yōu)化

由表2～3可知：響應(yīng)面模型的F值為18.801 3，P值為0.000 4，表明模型顯著，只有0.04%的可能性是由于噪聲造成了模型F值增大；A、A2、B2、C2是模型的顯著項(xiàng)，失擬項(xiàng)F值為3.628 9，P值為0.122 6，大于0.10，表明失擬項(xiàng)不顯著，模型選取恰當(dāng)。

通過模型預(yù)測，菌量（OD600nm）為0.66、培養(yǎng)時間為17.84 h、葡萄糖添加量為3.04%時，培養(yǎng)物上清液的總抗氧化活性最強(qiáng)，達(dá)到0.342 mmol Trolox/L。對模型預(yù)測的培養(yǎng)體系（菌量（OD600nm）0.66、培養(yǎng)時間17.84 h、葡萄糖添加量3.04%）進(jìn)行驗(yàn)證，培養(yǎng)物上清液的總抗氧化活性為（0.339±0.004） mmol Trolox/L，與模型預(yù)測值接近。表明模型建立較好，能夠比較準(zhǔn)確地預(yù)測培養(yǎng)體系與培養(yǎng)物上清液抗氧化活性之間的關(guān)系。由圖2～4可知：菌量對培養(yǎng)物上清液抗氧化活性的影響不顯著，曲面延A軸方向較平緩；培養(yǎng)時間與葡萄糖添加量對培養(yǎng)物上清液抗氧化活性的影響較顯著，曲面延B軸和C軸方向較陡峭。

表 2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Box-Behnken design with experimental results

表 3 二次模型響應(yīng)面方差分析Table 3 Analysis of variance (ANOVA) of response surface quadratic polynomial model

圖 2 菌量（OD600 nm）與培養(yǎng)時間交互作用的等高線圖與響應(yīng)面圖Fig. 2 Contour and 3D response surface plots showing the interactive effect of inoculum size (OD600 nm) and culture time on antioxidant activity of culture supernatant

圖 3 菌量（OD600 nm）與葡萄糖添加量交互作用的等高線圖與響應(yīng)面圖Fig. 3 Contour and 3D response surface plots showing the interactive effect of einoculum size (OD600 nm) and glucose concentration on antioxidant activity of culture supernatant

圖 4 培養(yǎng)時間與葡萄糖添加量交互作用的等高線圖與響應(yīng)面圖Fig. 4 Contour and 3D response surface plots showing the interactive effect of culture time and glucose concentration on antioxidant activity of the culture supernatant

2.4 培養(yǎng)物上清液的抗氧化活性成分分析

圖 5 不同處理后培養(yǎng)物上清液的總抗氧化活性Fig. 5 Total antioxidant activity of culture supernatant after different treatments

由圖5可知：100 ℃加熱后樣品的總抗氧化活性無顯著變化，表明活性物質(zhì)不是蛋白質(zhì)（蛋白質(zhì)加熱后會變性，喪失活性）；蛋白酶K處理后樣品的總抗氧化活性顯著降低，表明活性物質(zhì)可能是蛋白質(zhì)或生物活性肽（蛋白質(zhì)或生物活性肽含有肽鍵，會被蛋白酶K降解，因而活性發(fā)生改變）；β-葡萄糖苷酶和纖維素酶處理后樣品的總抗氧化活性沒有顯著變化，表明活性成分不是多糖（多糖會被β-葡萄糖苷酶和纖維素酶降解）。綜合以上分析，能夠確定樣品中的抗氧化活性物質(zhì)是生物活性肽。

2.5 固相萃取結(jié)果分析

圖 6 不同體積分?jǐn)?shù)乙腈洗脫產(chǎn)物的總抗氧化活性Fig. 6 Total antioxidant activity of eluates with different concentrations of acetonitrile

由圖6可知，乙腈體積分?jǐn)?shù)為80%時，洗脫產(chǎn)物的總抗氧化活性顯著較高，表明抗氧化肽的非極性較強(qiáng)，主要溶解在乙腈體積分?jǐn)?shù)為80%時的洗脫產(chǎn)物組分中。

2.6 超濾結(jié)果分析

由圖7可知，分子質(zhì)量＜3 kDa的超濾組分抗氧化活性顯著高于分子質(zhì)量＞3 kDa的超濾組分，表明活性肽分子質(zhì)量較小，無需酶切，可以直接進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。

圖 7 不同超濾組分的總抗氧化活性Fig. 7 Total antioxidant activity of different ultra fi ltration fractions

2.7 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析結(jié)果

通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，檢測到樣品中共有8 種肽，序列如表4所示。

表 4 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析檢測結(jié)果Table 4 Information about eight peptides identified by LC-MS-MS

2.8 抗氧化活性肽的預(yù)測與驗(yàn)證結(jié)果

通過BLAST比對，發(fā)現(xiàn)樣品中有1 個肽的序列與數(shù)據(jù)庫中的肽具有較高的相似度：七肽QYPLGPK和數(shù)據(jù)庫中的七肽HGPLGPL（ID 7889，來源于皮氏叫姑魚（Johnius belangerii）皮膚[28]）序列較為相似。

通過分子模擬，得到肽QYPLGPK的構(gòu)象如圖8所示，含有暴露在外的酪氨酸殘基（第2位）和賴氨酸殘基（第7位）。在肽中酪氨酸殘基的酚羥基可以作為氨基酸供體，賴氨酸殘基的氨基可以絡(luò)合金屬離子，有利于發(fā)揮抗氧化能力[29]。經(jīng)過驗(yàn)證，質(zhì)量濃度10 mg/mL肽QYPLGPK的總抗氧化活性為（0.249±0.011） mmol Trolox/L。

圖 8 通過分子模擬得到的肽QYPLGPK構(gòu)象圖Fig. 8 Conformation diagram of peptide QYPLGPK by molecular simulation

3 結(jié) 論

通過響應(yīng)面法優(yōu)化動物雙歧桿菌乳亞種B013培養(yǎng)上清液的抗氧化活性，得到最優(yōu)的培養(yǎng)體系為菌量（OD600nm）0.66、培養(yǎng)時間17.84 h、葡萄糖添加量3.04%。通過不同的酶和溫度處理，確認(rèn)培養(yǎng)物上清液的抗氧化活性來源于其中的生物活性肽。通過固相萃取和超濾對培養(yǎng)物上清液中的生物活性肽進(jìn)行分離純化，產(chǎn)物經(jīng)過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，確定出其中含有8 種肽。通過生物信息學(xué)和計(jì)算機(jī)模擬，篩選出其中有1 種肽（QYPLGPK）可能具有抗氧化活性。經(jīng)過驗(yàn)證，質(zhì)量濃度10 mg/mL的肽QYPLGPK的總抗氧化活性為（0.249±0.011） mmol Trolox/L。對于該抗氧化肽的作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

在生產(chǎn)實(shí)際應(yīng)用中，一方面可以直接將動物雙歧桿菌乳亞種B013開發(fā)為益生菌制劑，另一方面可以使用動物雙歧桿菌乳亞種B013開發(fā)乳品發(fā)酵劑，或?qū)碓从趧游镫p歧桿菌乳亞種B013的抗氧化肽作為食品添加劑，開發(fā)出具有抗氧化作用的功能食品。