劉倩琪

(廣東省深圳市農(nóng)業(yè)科技促進中心 廣東深圳 518054)

轉(zhuǎn)基因作物檢測是農(nóng)業(yè)安全監(jiān)管的基礎(chǔ)，目前國內(nèi)外檢測轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品最常用的方法有PCR核酸定性、定量法，該方法需要專業(yè)技術(shù)人員采用專用儀器設(shè)備進行檢測，檢測周期較長、檢測成本較高。試紙條法是一種簡便、快速的檢測方法，專業(yè)技術(shù)人員經(jīng)過簡單培訓(xùn)即可進行現(xiàn)場檢測。但鑒于目前轉(zhuǎn)基因作物種類和品系日漸增多，篩選基因、外源基因、外源蛋白等日趨增加，蛋白檢測試紙條的品牌、型號等也越來越多，因此，明確2種方法的準確性、特異性、靈敏度，比較2種檢測方法的優(yōu)劣，確定各自的適用范圍具有重要意義。

1 研究內(nèi)容

采用不同品牌試紙條檢測商業(yè)化轉(zhuǎn)基因水稻，比較各品牌試紙條的準確性、特異性、靈敏度。

采用PCR定性檢測法檢測轉(zhuǎn)基因水稻、標記基因及品系特異性序列，確定PCR法的局限性、準確性、靈敏度。

分析蛋白檢測試紙條法與PCR定性檢測法檢測結(jié)果的相關(guān)性；比較不同試紙條的優(yōu)缺點，及其各自的適用范圍。

2 研究材料

轉(zhuǎn)基因水稻汕優(yōu)63(TT51-1)品系4個濃度(5%、1%、0.5%、0%)樣品，由上海交通大學(xué)提供。

轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號(KF6)、Ⅱ優(yōu)科豐6號(Ⅱ優(yōu)KF6)、克螟稻(KMD)、M12品系1%粉末，由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心提供。

3 研究方法

按照轉(zhuǎn)基因水稻品系、檢測參數(shù)、外源蛋白等不同分別設(shè)計試驗方案，并確定每個品系采用的核酸檢測方法和試紙條類型。

3.1 PCR定性檢測法

采用農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒布的轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測相關(guān)檢測標準，對轉(zhuǎn)基因水稻不同品系各個參數(shù)進行檢測。

3.2 蛋白試紙條檢測法

本次試驗購買了8個品牌試的轉(zhuǎn)基因蛋白檢測的試紙條，其中，國內(nèi)品牌5個，分別是上海佑隆、中科院油料所、武漢上成、浙江拓普、廣州金標；進口品牌3個，分別是Agdia(美國)、Envirologix(美國)、Artron(加拿大)。檢測的蛋白涵蓋了常見的抗蟲、抗除草劑蛋白[1]。

4 結(jié)果與分析

4.1 PCR定性檢測法檢測不同轉(zhuǎn)基因水稻的準確性、特異性、靈敏度

采用KF6(1%)、Ⅱ優(yōu)KF6號(1%)、KMD(1%)、M12(1%)、TT51-1(濃 度 5%、1%、0.5%、0%)5個品系的陽性標準品，依據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒布的一系列轉(zhuǎn)基因成分檢測標準為依據(jù)，采用PCR定性檢測法檢測了4個篩選基因(CaMV35S、NOS、NPTⅡ、HPT)、1個 Bt目 的 基 因、3個 品 系(KMD、M12、TT51-1)特異性序列。結(jié)果(表1)顯示，各轉(zhuǎn)基因陽性標準品可以通過4個篩選基因(CaMV35S、NOS、NPTⅡ、HPT)及 1個 Bt目 的基因進行初步篩選檢測，每個品系檢測結(jié)果與此前所搜集到的各項轉(zhuǎn)基因水稻品系核酸檢測參數(shù)信息一致，根據(jù)篩選基因的檢測結(jié)果進行特異性更高的品系特異性檢測，3個品系(KMD、M12、TT51-1)特異性序列的檢測結(jié)果均為陽性。KF6、Ⅱ優(yōu)KF6號因缺乏相應(yīng)的檢測標準，而未能檢測。

此次試驗同時還檢測了TT51-1的 4個濃度梯 度 (5%、1%、0.5%、0%)， 其 中 NOS、Bt、TT51-1均能檢測到0.5%濃度。

4.2 不同試紙條檢測商業(yè)化轉(zhuǎn)基因水稻的準確性、特異性、靈敏度

采用 KF6(1%)、Ⅱ優(yōu) KF6(1%)、KMD(1%)、M12(1%)、TT51-1(濃度5%、1%、0.5%、0%)5個品系的陽性標準品，用8個品牌的Cry1Ab/Cry1Ac試紙條進行檢測。結(jié)果(表2)顯示，8個品牌的試紙條均能檢測出5%濃度的TT51-1。除了廣州金標試紙條僅能檢測出5%濃度TT51-1，其余所有樣品的檢測結(jié)果均為陰性。武漢上成、浙江拓普、上海佑隆和Envirologix 4個品牌的試紙條檢測1%KF6、1%Ⅱ優(yōu)KF6、1% KMD、TT51-1(5%、1%、0.5%)結(jié)果均為陽性。油料所、Agdia、Artron 3個品牌的試紙條均能檢測出1% KF6、1% Ⅱ優(yōu)KF6、1%KMD、1% M12、5% TT51-1，但無法檢測出0.5%TT51-1。各品牌試紙條檢測M12結(jié)果均為陰性，即M12含有抗除草劑EPSPE蛋白，但不含有抗蟲Cry1Ab/Cry1Ac蛋白。同時，8個品牌的試紙條均無法鑒定轉(zhuǎn)基因水稻品系[2]。

表1 水稻PCR檢測結(jié)果

表2 不同品牌試紙條檢測轉(zhuǎn)基因水稻結(jié)果比較

5 結(jié)論

5.1 PCR核酸定性檢測法與試紙條檢測法的局限性比較

目前，檢測水稻中轉(zhuǎn)基因成分的商業(yè)化試紙條只有Bt-Cry1Ab/1Ac免疫診斷試紙條，其他抗病毒、品質(zhì)改良的轉(zhuǎn)基因水稻品系都無法檢測。已知的9個轉(zhuǎn)基因水稻品系中只有4個品系含有Cry1類抗蟲蛋白，也就是說，現(xiàn)有的試紙條只能檢測轉(zhuǎn)Cry1類抗蟲蛋白的品系[3]。PCR定性檢測法可以檢測水稻中CaMV35S、NOS、Bt、hpt、SCK等參數(shù)，在已知的9個轉(zhuǎn)基因水稻品系中至少含有CaMV35S、NOS、Bt、hpt中的一個參數(shù)，漏檢概率遠遠小于試紙條檢測法。

5.2 PCR核酸定性檢測法與試紙條檢測法的準確性比較

由于現(xiàn)有商業(yè)化試紙條只能檢測Cry1類抗蟲蛋白，具體是Cry1Ab、Cry1Ac，還是Cry1Ab/1Ac，需要多張試紙條才能檢測，且無法判斷品系。此外，試紙條檢測需要提取樣品中的粗蛋白，現(xiàn)場檢測存在粉碎樣品、沉淀或離心、清洗等條件的局限，一般存在取樣量較少、樣品代表性不夠等問題，而國產(chǎn)試紙條的靈敏度只有1%，因此存在漏檢(即假陰性)的風(fēng)險。PCR定性檢測法可直接檢測轉(zhuǎn)基因水稻中的外源基因片段，對于有爭議的陽性結(jié)果還可以采用酶切、測序等方法輔助判斷，因此，準確性遠遠高于試紙條檢測法。

5.3 PCR核酸定性檢測法與試紙條檢測法的靈敏性比較

目前僅GB/T 19495.8—2004規(guī)定了轉(zhuǎn)基因植物蛋白檢測方法，主要針對抗蟲基因Cry1Ab/1Ac試紙條法。該標準規(guī)定試紙條法主要檢測轉(zhuǎn)基因棉花中的Cry1Ab/1Ac蛋白，同時也適用于其他含有Cry1Ab/1Ac蛋白的轉(zhuǎn)基因植物，但檢測靈敏度必須保證在0.25%以上。而現(xiàn)有國產(chǎn)轉(zhuǎn)基因Cry1Ab/1Ac快速測試紙條的靈敏度為1%，進口試紙條檢測靈敏度大于0.1%。根據(jù)資料以及本單位做過的若干次核酸定性試驗的數(shù)據(jù)顯示，一般PCR定性檢測的靈敏度能達到0.1%；若以基體陽性樣品為材料，最高的靈敏度能達到0.05%；若以DNA陽性樣品為材料，最高的靈敏度能達到0.01%。