張鳳霞，王國棟

現(xiàn)代代謝組學平臺建設及相關技術應用

張鳳霞，王國棟

中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所，植物基因組學國家重點實驗室，種子創(chuàng)新研究院，北京 100101

代謝組作為生命科學研究的5個層面(基因組、轉錄組、蛋白質組、代謝組和表型組)之一越來越受到科研工作者的關注。色譜–質譜聯(lián)用技術由于其高分離能力、高靈敏度等優(yōu)點在代謝組學(定性和定量)領域發(fā)揮重要的作用，基于色譜–質譜聯(lián)用技術的代謝組學已成功應用于代謝表型差異研究、基因功能鑒定和轉基因生物安全性評價等多個研究方向。本文以中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所代謝組學平臺為例，詳細介紹了現(xiàn)代代謝組學平臺色譜–質譜聯(lián)用儀器的硬件組成，以及不同技術平臺在現(xiàn)在系統(tǒng)生物學研究中的具體應用。

小分子化合物；代謝組學平臺；色譜–質譜聯(lián)用；系統(tǒng)生物學

小分子代謝物作為細胞調控過程的終產物，其種類和數(shù)量的變化被視為生命體對基因或環(huán)境變化的最終響應，對這些化合物在動態(tài)和靜態(tài)上進行全面的定性定量分析，即為代謝組學研究。它是目前系統(tǒng)生物學研究的一個重要組成部分，主要通過鑒定動植物體內代謝物變化與特定基因表達變化之間的聯(lián)系，研究代謝產物在動植物生長發(fā)育與環(huán)境之間應答中的作用，從而進一步揭示生物體在特定時間、特定環(huán)境下代謝網(wǎng)絡的整體狀態(tài)，深入解析生命活動規(guī)律的內在機制[1]。根據(jù)不同的研究目的，代謝組學可以籠統(tǒng)劃分為靶標代謝組學與非靶標代謝組學；從應用技術層面上代謝組學研究又可以分為代謝靶標分析(target analysis)、代謝輪廓分析(met-abolic profiling analysis)、代謝指紋分析(metabolic fingerprinting analysis)及代謝組學(metabolomics)等4個層次[2]。目前，色譜–質譜聯(lián)用技術是代謝組學研究中的主流檢測技術，常用儀器包括氣相色譜–質譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)、液相色譜–質譜聯(lián)用(liquid chromatography- mass spectrometry, LC-MS)和毛細管電泳質譜聯(lián)用(capillary electrophoresis-mass spectrometry, CE-MS)等。本文將以中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所代謝組學平臺為例，從代謝組學平臺的硬件組成和實際應用兩個層面逐一介紹。

1 代謝組學平臺常用硬件設施

中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所代謝組學平臺是在研究所和植物基因組學國家重點實驗室的大力支持下成立的。該平臺是以色譜–質譜聯(lián)用分析技術為基礎的小分子代謝物定性和定量分析平臺，建立針對不同化學性質代謝產物(如揮發(fā)性、高極性等化合物、低豐度的植物激素等)的分析方法，形成能夠多層次、多角度地對各種生物組織進行代謝靶標、代謝輪廓以及代謝指紋分析能力。2009年研究所啟動了代謝組學平臺建設，2010年購置、安裝第一臺氣相色譜–質譜聯(lián)用儀，2011年購置高靈敏、高通量的超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質譜聯(lián)用儀(ultra high performance liquid chromatography coupled to triple quadrupole mass spectrometer, UHPLC-MS- QQQ)，2013年安裝了高分辨的超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質譜聯(lián)用儀(ultra high performance liquid chromatography coupled to ion mobility quadrupole- time of flight mass spectrometer, UHPLC-MS-Q-TOF)，2018年配備了高分辨、高靈敏且具有離子淌度功能的超高效液相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質譜聯(lián)用儀(UHPLC-MS-IM-Q-TOF)，引入了第三維度的分離功能。這些大型質譜儀均配備了大功率UPS電源(unin-terruptible power supply, UPS)，避免了意外斷電對質譜儀造成的損害，保障了大型質譜儀的正常運行。圖1所示為代謝組學平臺目前所擁有的大型質譜儀。同時還配備有氮氣發(fā)生器、空氣壓縮機、氮氣發(fā)生器及空壓機一體機和大型精密空調，既保證了質譜儀的連續(xù)供氣，又為質譜儀提供一個溫度恒定的環(huán)境。另外，實驗室還配備了2臺光照培養(yǎng)箱、2臺全自動調節(jié)植物溫室等植物培養(yǎng)必需設備、3臺 ?80℃超低溫冰箱、1臺高速冷凍離心機、2臺小型控溫離心機、1臺真空濃縮儀、1臺樣品研磨儀、1套氮吹儀、1套旋轉蒸發(fā)儀、3臺精密天平、1臺冷凍干燥儀、多臺渦旋儀和超聲儀等樣品保存與預處理必須設備，保障了代謝組學平臺工作的順利開展。

2 代謝組學平臺技術與應用

色譜法(chromatography)是一種物理或化學分離的分析方法，分離原理主要是利用物質在流動相與固定相之間的分配系數(shù)差異而實現(xiàn)分離，是分析混合物最有力的手段，具有高靈敏度、高選擇性、高效能、分析速度快和應用范圍廣等優(yōu)點[3]。質譜分析法(mass spectrometry, MS)是將化合物形成離子和碎片離子，按其質荷比()的不同進行分離測定，以及成分和結構鑒定的一種分析方法，具有應用范圍廣、靈敏度高和分析速度快的特點[3]。色譜法進行定性的依據(jù)是保留值，很難對復雜混合物進行準確定性；而質譜法具有很強的結構鑒定能力，可以測定化合物的分子量、分子式及有關結構信息，但其不具備分離能力，很難直接對復雜混合物進行定性，因此色譜與質譜技術聯(lián)用可同時實現(xiàn)復雜混合物的分離、定性與定量的目的[4]。在色譜與質譜聯(lián)用系統(tǒng)中，色譜充當了質譜的分離和進樣裝置，而質譜則是色譜的檢測器，既彌補了各自的不足，又發(fā)揮了各自的功能優(yōu)勢。

圖1 基于色譜–質譜聯(lián)用技術的代謝組學平臺儀器構成

A：7980A-5975C GC-MS；B：1290 Infinity UHPLC-6495 QQQ MS；C：1290 Infinity UHPLC-G6550A Q-TOF MS；D：1290 Infinity II UHPLC-G6560B Ion Mobility Q-TOF MS。

代謝組研究所分析的化合物分子量大小、含量、極性、揮發(fā)性等物理化學性質差異較大，因此要求分析方法具有高靈敏、高通量和無偏向性的特點，至今為止，尚未有一種分析方法能夠滿足上述所有要求。而色譜–質譜聯(lián)用技術既具有色譜的高分離度、高通量也具有質譜的普適性、高靈敏度和高專一性，因而成為代謝組學研究最主要的工具[5~11]。

代謝組學平臺目前擁有先進且功能互補的色譜–質譜聯(lián)用儀。該平臺的技術特色主要是利用色譜–質譜聯(lián)用技術從多層次、多角度對代謝小分子進行快速定性、定量分析。根據(jù)個性化的科研需求已建立了涵蓋代謝組學、代謝輪廓和代謝靶標分析的20多種分析方法。下面將對不同代謝組學技術平臺的應用進行詳細介紹。

2.1 基于GC-MS技術的代謝組學平臺

GC-MS具有儀器性能穩(wěn)定、分析重復性好、靈敏度高等特點，有豐富的質譜庫可用于化合物的定性，且可提供保留指數(shù)信息以輔助定性，適于揮發(fā)性、半揮發(fā)性化合物或者經(jīng)衍生后具有揮發(fā)性的熱穩(wěn)定性好的化合物檢測。目前，GC-MS技術已經(jīng)比較成熟，在所有聯(lián)用技術中發(fā)展最為完善，應用很非常廣泛，已成為代謝組學研究的最有利的工具之一[12~16]。

近年來，代謝組學在農作物研究領域及動物的發(fā)育研究中被廣泛應用[17~22]，為滿足科研人員的科研需求，代謝組學平臺相繼開發(fā)了基于GC-MS技術的代謝組學、代謝輪廓及代謝靶標的分析方法。首先，在前人研究的基礎上本課題組改進了主生代謝產物的提取及衍生方法，避免了兩步衍生法中易出現(xiàn)的衍生不完全的問題，實現(xiàn)了對生物體中三羧酸循環(huán)、糖酵解、氨基酸、脂肪酸等代謝途徑相關代謝物的高靈敏檢測。該方法已被成功應用于擬南芥()、水稻(L.)、棉花(spp)、油菜(L.)、大豆((Linn.) Merr.)、煙草(L.)、果蠅()和藍藻()等生物組織的相關研究中[23~41]。其中，Tan等[23]利用該方法通過檢測轉基因擬南芥種子中葡萄糖、果糖和蔗糖的含量，以及檢測轉基因油菜籽中油脂的含量，證明了和是油菜遺傳改良的可靠靶點，該方法在分子育種上具有一定的技術可行性，可推廣應用于其他油料作物的改良中。Ding等[26]通過對突變體果蠅脂肪組織進行的代謝組分析，發(fā)現(xiàn)突變體在糖酵解通向線粒體三羧酸循環(huán)的代謝環(huán)節(jié)出現(xiàn)了瓶頸，導致合成脂肪的原料(檸檬酸)含量大幅度減少；該研究發(fā)現(xiàn)鈣離子依賴的線粒體代謝維持脂肪細胞脂質穩(wěn)態(tài)，揭示了-鈣離子–線粒體代謝–脂肪儲積的調控途徑，為致病基因的分子功能和機體脂肪代謝調控提供了新的認知，也為脂肪營養(yǎng)不良疾病提供了多個潛在治療手段。

其次，本平臺建立了植物體中揮發(fā)性代謝物譜的檢測方法。該方法采用固相微萃取(solid phase micro-extraction, SPME)裝置對樣品中的揮發(fā)性化合物進行富集，而后再進行GC-MS分析，可同時檢測醛、酮類化合物、單萜及倍半萜類等揮發(fā)性小分子代謝物。該方法已成功應用于蔬菜作物黃瓜(L.)、番茄(Mill.)，農作物類小麥(L.)、水稻以及模式植物擬南芥等植物樣品中揮發(fā)性代謝物的檢測[27,28]。Wei等[28]系統(tǒng)分析了黃瓜測序品種9930的不同發(fā)育階段的共計23個樣品組織的揮發(fā)性化合物，共檢測到85個揮發(fā)性化合物，有多達36種揮發(fā)性萜類化合物，且揮發(fā)性化合物的含量呈現(xiàn)出組織特異性。他們通過基因–揮發(fā)物關聯(lián)分析的方法構建了黃瓜揮發(fā)性化合物的代謝網(wǎng)絡，系統(tǒng)性研究和闡明黃瓜揮發(fā)性化合物的生物合成通路和調控的分子機制。該研究也為進一步明確揮發(fā)性化合物在植物–環(huán)境互作中的生理功能，以及黃瓜風味品質改良育種奠定了堅實基礎。

本平臺還建立了植物葉片或花藥組織中角質、蠟質和總脂肪酸代謝譜的分析方法，為農作物的育種研究提供了很好的技術支持。該方法可以實現(xiàn)只需提供1份樣品即可得到3類代謝譜的數(shù)據(jù)，解決了珍貴樣品取樣難的問題。同時，要注意采樣及與預處理過程中保持樣品的完整性，否則植物組織內源性的小分子化合物就會泄露出來，尤其會影響表面蠟質的代謝譜，造成譜圖中出現(xiàn)“雜質峰”。圖2為植物體表面蠟質、角質以及脂肪酸代謝分析的總離子流色譜圖。目前為止，利用該方法已成功檢測了擬南芥和鹽芥()葉片、玉米(L.)葉片與花藥、小麥葉片以及水稻葉片和花藥組織[31,32]。Chen等[31]采用該方法檢測了玉米花藥中的蠟質和角質組成，結果表明()參與了玉米C16/C18 ω-羥基脂肪酸的氧化途徑，并與和共同調控花藥角質層和花粉外分泌的發(fā)育。

2.2 基于UHPLC-MS技術的代謝組學平臺

UHPLC-MS是由超高效液相色譜儀、離子源和質譜儀構成。其中較常用的離子化技術包括電噴霧電離(electrospray ionization, ESI)和大氣壓化學電離(atmospheric pressure chemical ionization, APCI)。ESI比較適合分析極性化合物，同時它還可以生成多電荷離子，因此也能夠分析一些生物大分子(如蛋白質、多肽等)。APCI主要產生單電荷離子，適于分析非極性和弱極性小分子代謝物。作為UHPLC的檢測器，三重四極桿質譜具備全掃描、子離子掃描、母離子掃描、中性丟失掃描以及多反應監(jiān)測掃描等多種掃描模式，具有高靈敏和高選擇性的特點。因此，UHPLC-MS-QQQ在化合物的快速篩選及復雜基質中微量靶標代謝物的定量分析中有著獨特的優(yōu)勢，在代謝靶標分析中的應用最為廣泛[42~44]。但是，由于其分辨率較低，故而在化合物鑒定中的表現(xiàn)稍微遜色。而UHPLC-MS-QTOF具有高靈敏、高通量和高分辨率的特點；它既可以在一級質譜圖中可提供精確的分子質量，又可以從二級質譜圖中得到豐富的離子碎片的精確質量數(shù)信息。它可用于化合物的定量，并在化合物的定性分析中具有絕對優(yōu)勢，因此，多被用于非靶標代謝組學或代謝輪廓分析。具有離子淌度功能的四級桿串聯(lián)飛行時間質譜儀還可以為代謝物的鑒定提供“第三維”分離信息—碰撞截面積(collision cross section, CCS)，大大提高了代謝物定性的準確性。CCS值具有一定專屬性，可用于區(qū)分同分異構體以及帶電荷數(shù)。離子淌度質譜在脂質組學、區(qū)分D和L型氨基酸異構體、聚糖異構體以及糖結合物的分離鑒定中發(fā)揮了很好的作用[45~48]。因此，具有離子淌度功能的UHPLC-MS- QTOF將在代謝物的結構鑒定中發(fā)揮其優(yōu)異的作用。

圖2 基于氣相色譜–質譜聯(lián)用技術的植物體表面蠟質、角質及總脂肪酸代謝譜分析

根據(jù)個性化的研究需求，代謝組學平臺建立了高靈敏、高通量的NAD代謝途徑中相關代謝物的代謝靶標的定量分析方法，可同時檢測18種相關代謝物。在此基礎上，充分利用平臺儀器的優(yōu)勢功能，提出了整合UHPLC-MS-QTOF與UHPLC-MS-QQQ技術的研究策略來研究NAD補救合成途徑中相關基因的功能，并解析NA衍生物在植物代謝中的分子機制及其生理功能[49~51]。首先，利用高分辨的UHPLC-MS-QTOF對野生型(Col-0)和突變體的擬南芥樣品進行代謝組學分析，結果在突變體中發(fā)現(xiàn)了兩個差異比較顯著的質譜信號，經(jīng)推測應為NA的六碳糖糖基化產物(質譜測量誤差分別為1.75 ppm和0.35 ppm)。通過對兩個化合物的二級質譜分析及對應的酶活產物作為標準品進行驗證，鑒定出兩個化合物分別為NA的羧酸位和氮位的葡萄糖基化產物。其次，利用UHPLC-MS-QQQ技術分別對不同基因型的擬南芥干種子和萌發(fā)種子進行NAD相關代謝物的定量分析，結合其他生理生化的實驗結果證明了NAGT活性是在十字花科植物進化過程中才逐漸獲得，NAGT活性的獲得為植物適應環(huán)境提供選擇優(yōu)勢。該研究同時為進一步研究植物中其他NA衍生物的生物學功能奠定了基礎[49]。

另外，平臺還建立了高靈敏、高通量的基于UHPLC-MS-QQQ技術的氨基酸定量分析方法。圖3為20種游離氨基酸分析的典型總離子流圖，在9分鐘內實現(xiàn)了20種氨基酸的快速分離檢測，該方法可用于各種植物組織、動物組織及微生物等各生物體中的游離氨基酸的檢測。Zhou等[52]利用該方法通過對秀麗線蟲和小鼠模型的研究，證明了賴氨酸的正常代謝對于線粒體穩(wěn)態(tài)的維持以及動物的發(fā)育是必須的。人類Ⅱ型高賴氨酸血癥(酵母氨酸血癥)是一種嚴重影響人類發(fā)育的氨基酸代謝缺陷癥，本研究揭示了該病的發(fā)病機理，并為其治療提供了重要依據(jù)。

圖3 基于液相色譜串聯(lián)三重四級桿質譜技術的生物體內游離氨基酸代謝譜分析

1：L-His；2：L-Asn；3：L-Arg；4：L-Gln；5：L-Ser；6：L-Gly；7：L-Asp；8：L-Glu；9：L-Thr；10：L-Ala；11：L-Pro；12：L-Orn；13：L-Lys；14：L-Tyr；15：L-Met；16：L-Val；17：L-Ile；18：L-Leu；19：L-Phe；20：L-NorLeu(IS)；21：L-Trp。

本平臺建立了基于UHPLC-MS-QTOF技術的多個種類代謝物的代謝輪廓分析方法，包括黃酮和異黃酮類代謝譜分析、三萜皂苷類代謝譜分析及萜酚類代謝譜分析等。前期本課題組綜合代謝組學、轉錄組學和生化等技術手段對啤酒花()苦味酸生物合成途徑進行了系統(tǒng)研究, 功能鑒定短側鏈脂肪酸CoA連接酶[53]。近年來，Li等[54]和Ban等[55]利用UHPLC-MS QTOF技術的代謝輪廓分析方法結合UHPLC-MS-QQQ技術的靶標化合物定量的方法相繼深入解析了苦味酸和黃腐醇的的生物合成途徑。Ban等[55]研究發(fā)現(xiàn)并鑒定兩個不具備催化活性的查爾酮異構酶基因(和)參與并調控啤酒花中黃腐醇的生物合成。發(fā)現(xiàn)能夠與黃腐醇合成通路中上下游蛋白查爾酮合成酶(CHS)和膜定位的異戊烯基轉移酶()互作并提高它們的活性，形成的代謝復合體可以高效催化黃腐醇的生物合成；而則能夠結合黃腐醇代謝途徑中柚皮素查爾酮和脫甲基黃腐醇等中間化合物，穩(wěn)定這些化合物的開環(huán)結構，進而維持其生理活性。同時還進一步發(fā)現(xiàn)結合并提高酶促活性的功能在所有的陸生植物中是保守，暗示其在植物從水生到陸生的演化過程中曾發(fā)揮著重要作用。

2.3 代謝組學平臺應用服務范圍

本平臺自成立以來，緊跟研究所的發(fā)展需求，開發(fā)個性化的技術方法，及時滿足科研人員的科研需求，既得到了研究所的肯定，也得到了科研人員的一致好評。截至2018年底，儀器總運行有效機時約為25 000 h，其中約5000 h為對外服務測試的有效機時，對外服務測試樣本數(shù)約15 000個。與平臺合作過課題組(研究所內及北京生命科學大型儀器區(qū)域中心各單位)約為50多個，合作發(fā)表文章30余篇，合作單位包括清華大學、北京大學、北京科技大學、中國水稻所、北京大北農科技集團股份有限公司生物技術中心、四川農業(yè)大學、中國農業(yè)大學、云南大學、山東農業(yè)大學、中國農業(yè)科學院蔬菜研究所和青島煙草所等多個科研單位。代謝組學平臺可提供各種生物體的代謝組學、代謝輪廓及代謝靶標分析的科研服務工作，已開發(fā)的方法詳見表1。

3 結語與展望

色譜–質譜聯(lián)用技術強大的分離能力和高靈敏度的檢測能力為代謝組分析提供了強有力的技術保障。未來更快速的液相色譜技術及高端的質譜技術的出現(xiàn)將會為現(xiàn)代代謝組學平臺的發(fā)展注入新的動力。目前，代謝組分析的瓶頸為代謝物的結構鑒定(即定性分析)。色譜–質譜聯(lián)用技術是鑒定代謝物最直接有效的辦法，即將代謝物的保留時間、精確質量數(shù)、多級質譜碎片同標準品進行比對確認，但是實際研究中往往無法獲得商品化的代謝物的標準品。所以，在色譜–質譜聯(lián)用技術平臺的基礎上引入核磁共振技術(nuclear magnetic resonance, NMR)將是未來代謝組分析的主要發(fā)展方向之一。另外一個值得關注的發(fā)展方向就是質譜成像技術(mass spec-trometry imaging, MSI)，其優(yōu)點是直接分析生物樣品的切片，相對于傳統(tǒng)的色質分析技術對樣品的破壞性，質譜成像技術可以獲得與生物學問題更為直接的小分子化合物的分布和相對定量信息。目前質譜成像技術不但可以繪制出對應分子或離子在生物樣本的二維分布圖，也可以通過對連續(xù)切片的二維分布圖進行進一步軟件處理，獲得待測物在樣本中的三維空間分布。隨著生物樣品制備和質譜技術的飛速發(fā)展，質譜成像技術(特別是與轉錄組和蛋白組數(shù)據(jù)結合)將會有越來越廣泛的應用[56]。

表1 代謝組學平臺已開發(fā)的分析方法

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Current metabolomics platforms: technical composition and applications

Fengxia Zhang, Guodong Wang

Metabolomics (defined as comprehensive small molecule chemical analysis), together with genomics, transcriptomics, proteomics and phenomics, now plays a fundamental role in system biological studies. Chromatography- mass spectrometry machines, which have the characteristics of high resolution and high sensitivity, are widely used for metabolomics analysis, both qualitatively and quantitatively. With the fast development of the chromatography-mass spectrometry technology, metabolomics analysis has been successfully applied in various biological research fields. Here, we introduce the different chromatography-mass spectrum machines used for metabolomics analysis and their applications to various biological issues by mainly using the metabolomics platform in Institute of Genetics and Developmental Biology as a casestudy.

small molecule chemicals; metabolomics platform; chromatography-mass spectrometry; system biology

2019-04-30;

2019-06-30

植物基因組學國家重點實驗室(編號：SKLPG2016A-13，SKLPG2016B-13)資助[Supported by the State Key Laboratory of Plant Genomics of China (Nos. SKLPG2016A-13, SKLPG2016B-13)]

張鳳霞，博士，工程師，研究方向：代謝組學分析方法及應用。E-mail: zhangfx@genetics.ac.cn

王國棟，博士，研究員，研究方向：植物功能代謝組學。E-mail: gdwang@genetics.ac.cn

10.16288/j.yczz.19-122

2019/8/12 14:49:56

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20190812.1449.003.html

(責任編委: 楊永華)