田秀梅，王曉麗，彭士濤，，趙俊杰，王旭，邱濱濱

(1.天津理工大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與安全工程學(xué)院，天津 300384；2.交通部天津水運工程科學(xué)研究所 水路交通環(huán)境保護(hù)技術(shù)交通行業(yè)重點實驗室，天津 300456)

溢油事故嚴(yán)重制約了海洋生態(tài)平衡和經(jīng)濟(jì)發(fā)展[1-2]。從現(xiàn)有的海洋溢油清理技術(shù)來看，微生物固定化技術(shù)因能克服菌體流失、與浮油接觸較難等弊端而備受關(guān)注[3-6]。在固定化技術(shù)應(yīng)用中，生物載體的選擇至關(guān)重要。載體的生物相容性、疏水性、吸附性和可浮性是去除石油烴的關(guān)鍵[7-9]。本研究選擇部分老齡、副產(chǎn)品苧麻纖維廢棄物為載體，進(jìn)行乙酸改性，然后將其應(yīng)用于固定化微生物技術(shù)中不僅可以實現(xiàn)海洋污染修復(fù)，還能達(dá)到廢棄物資源化利用。通過研究乙酸改性苧麻纖維固定化石油降解菌群的降解性能，為實際海洋溢油污染修復(fù)提供技術(shù)支持。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

高效石油降解菌：醋酸鈣不動桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)、鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)、威尼斯不動桿菌(Acinetobactervenetianus)、紅球菌(Rhodococcussp.)均為自制，將4株菌擴(kuò)大培養(yǎng)后按2∶2∶2∶4的體積比混合成混合菌液。

培養(yǎng)基：①無機(jī)鹽培養(yǎng)基(MSM)：NaCl 0.5 g、KH2PO41.5 g、K2HPO41.5 g、NH4NO33.0 g、Mg2SO4·7H2O 0.1 g，F(xiàn)eCl20.01 g、CaCl20.01 g；蒸餾水1 000 mL，初始pH為7.2±0.2。②固定化培養(yǎng)基：NaCl 5 g、牛肉浸膏5 g、蛋白胨10 g，去離子水1 000 mL，pH為7.2±0.2。

SU3500掃描電子顯微鏡；UV9600紫外分光光度計；TENSOR37傅里葉紅外光譜儀；GC-2010型島津氣相色譜儀。

1.2 乙酸改性苧麻纖維[10]

將20～40目的苧麻纖維置于500 mL的圓底燒瓶中，加入一定濃度的乙酸改性劑，油浴加熱100 ℃，恒溫回流2～6 h，磁子轉(zhuǎn)速60 r/min。加熱后，用蒸餾水將苧麻纖維清洗至中性，60 ℃鼓風(fēng)干燥，得到乙酸改性的苧麻纖維。

1.3 吸附法固定微生物

稱取0.5 g苧麻纖維倒入50 mL固定化培養(yǎng)基中，121 ℃、30 min滅菌。取5 mL混合菌液接至固定化培養(yǎng)基中溫育，30 ℃、170 r/min下振蕩培養(yǎng)36 h。4 000 r/min、30 ℃條件下離心固定化載體10 min，傾去上清液，加入生理鹽水清洗3次，得到固定化菌劑。通過SEM、FTIR分析載體特征及微生物附著生長情況。

1.4 游離和固定化菌對原油的去除

用二氯甲烷萃取MSM介質(zhì)中的殘余原油，用紫外-可見分光光度法測定原油總?cè)コ?。過濾提取生物載體上吸附的原油計算吸附率。生物降解率為總?cè)コ俾蕼p去吸附率。

1.5 不同環(huán)境因素對游離和固定化菌的降解影響

測定游離和固定化菌在不同溫度(15，20，25，30，35 ℃)、pH值(4，5，6，7，8和9)、鹽度(15‰，20‰，25‰，30‰和35‰)條件下培養(yǎng)7 d后的生物降解率，每個處理重復(fù)3次。

1.6 游離和固定化菌對正構(gòu)烷烴的降解

使用氣相(GC-FID)測定烷烴的去除率。GC-FID檢測條件：載氣為高純氮，進(jìn)樣口和FID溫度分別為290，300 ℃。進(jìn)樣量1 μL，手動進(jìn)樣，不分流。峰面積歸一化法定量分析烷烴的殘留量，計算如式(1)所示：

(1)

式中Ci——某烴組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；

Ai——某烴組分的峰面積；

fi——某烴組分的質(zhì)量校正因子。

2 結(jié)果與討論

2.1 游離和固定化菌對原油去除

以未改性和乙酸改性苧麻纖維為載體，固定化菌和游離菌群的原油去除效果見圖1。

圖1 吸附固定菌對原油的去除Fig.1 Oil removal rate of petroleum bacteria immoblized by sorption

由圖1可知，未改性和乙酸改性固定化菌的總?cè)コ史謩e為83.74%和96.39%。培養(yǎng)7 d后，生物降解原油發(fā)揮主要作用。與游離菌(66.73%)相比，固定化菌的生物降解率顯著提高，固定化菌在改性前后的生物降解率分別為77.37%和85.16%。改性前后苧麻纖維載體的吸附去除率僅為6.34%，11.23%，這表明即使生物載體是一種優(yōu)異的吸附劑，但當(dāng)其與生物技術(shù)結(jié)合時，吸附更多的是起到協(xié)同生物降解的作用[11]。通過吸附固定的方式能夠有效地提高生物降解率，維持較高的總?cè)コ省?/p>

2.2 載體及固定化菌的微觀結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 FTIR分析 苧麻纖維改性前后的紅外光譜圖見圖2。

圖2 改性前后苧麻纖維FTIR圖Fig.2 The FTIR spectra of crude ramie fiber and modified ramie fiber

2.2.2 SEM分析 苧麻纖維載體及固定化微生物的SEM見圖3。

圖3 改性前(a)、改性后(b)、固定化菌劑(c、d)樣品的掃描電鏡圖Fig.3 SEM micrograghs of raw，modified samples and immobilized bacteria

由圖3a可知，原始苧麻纖維表面平滑，結(jié)構(gòu)規(guī)則平整、致密，而乙酸改性后的苧麻纖維表面粗糙、疏松，有豐富的孔隙結(jié)構(gòu)(圖3b)。這為微生物的生長、代謝和固著提供有利條件。乙酸改性的苧麻纖維能將微生物吸附在中空纖維素管內(nèi)部及縫隙間，形成高濃度菌群?；旌暇撼蓤F(tuán)狀生長，菌體形態(tài)均勻，且細(xì)胞自身產(chǎn)生的胞外聚合物增強了對載體材料的粘附，活性未受到影響，說明載體有良好的生物親和性。因此，選擇乙酸改性的苧麻纖維為固定載體。

2.3 不同環(huán)境因素對游離和固定化菌的降解影響

環(huán)境溫度、pH、鹽度對游離菌與固定化菌降解影響見圖4。

圖4 不同環(huán)境因素對游離和固定化菌的降解影響Fig.4 Effects of different environmental factors on the degradation of petroleum by free and immobilized bacteria

由圖4a可知，游離和固定化菌在30 ℃時均具有最高的油降解水平，分別為67.75%，86.91%。游離和固定化菌的油降解合適溫度范圍分別為25～30 ℃和25～35 ℃，表明固定化菌的溫度范圍比游離菌群的溫度范圍寬。此外，低溫條件下，固定化菌對石油的降解效率明顯較高(圖4a)。固定菌的降解速率的變化不如游離菌群那么敏感，這說明載體一定的隔熱保溫作用能使固定化菌更好地適應(yīng)溫度的變化。

由圖4b可知，pH為5～8時，固定化菌和游離菌群的降解趨勢相對穩(wěn)定。但當(dāng)pH升至9.0時，游離菌群的降解效率迅速下降了19%，細(xì)菌的降解活性受到抑制。相反，固定化菌保持良好的原油降解效果，這表明固定化細(xì)菌對堿性條件的耐受能力優(yōu)于游離菌。

由圖4c可知，在本研究范圍內(nèi)，鹽度對游離和固定化菌降解原油的影響很小?？傮w來說，隨鹽度含量的變化，原油降解呈先上升后降低的趨勢。當(dāng)鹽度為30‰時，游離和固定化菌的降解效果最好，分別為72.45%，87.44%。

2.4 游離和固定化菌對烷烴的降解

圖5為游離菌群和固定化菌對原油的降解情況。

圖5 原油成分氣相色譜圖Fig.5 Gas chromatograms of crude oila.空白對照；b.游離菌；c.固定化菌

由圖5可知，游離菌和固定化菌對原油成分有不同程度的降解。游離與固定化菌對烷烴降解后含量變化見圖6。

圖6 游離和固定化菌對烷烴的降解Fig.6 Degradation of n-alkanes by free and immobilized bacteria

由圖6可知，固定化菌對烷烴的降解效果遠(yuǎn)高于游離菌，7 d后游離和固定化菌對烷烴的平均降解率為67.86%，86.28%。這歸因于苧麻纖維吸附原油增加了與細(xì)菌的接觸面積，并提高了生物降解。此外，固定化菌對短鏈烷烴(C12～C20)的降解效果最佳(94.85%)，這是因為固定化載體的疏水親油性增加了對石油烴的吸附，對烷烴起到了富集效果，且短鏈烷烴相對于中長鏈烷烴(C27～C37)更容易進(jìn)入載體內(nèi)部被微生物攝取，進(jìn)而提高了對短鏈烷烴的降解。因此，改性苧麻纖維的疏水吸油性有效地促進(jìn)了固定化菌劑對浮油的生物降解。

2.5 吸附-協(xié)同生物降解假設(shè)模型

圖7顯示了整個吸附-生物降解過程。

由圖7可知，當(dāng)石油污染物在海洋中擴(kuò)散時，迅速以浮油的形式漂浮在海面上形成疏水層，阻礙了傳質(zhì)過程和微生物的呼吸作用。乙酸改性苧麻纖維載體是吸附劑，將原油吸附到材料的表面及孔隙中，從而控制油的擴(kuò)散，同時實現(xiàn)油與固定化細(xì)菌直接接觸。

圖7 固定化菌的整個吸附-生物降解過程Fig.7 Whole adsorption-biodegradation process of immobilized bacteria

整個過程主要有兩個階段，第一階段為主要吸附過程，載體的吸附作用可以短時間內(nèi)降低海洋中石油濃度；然后進(jìn)入第二階段，即生物降解過程。載體上固定的石油降解菌群以石油烴為碳源，最終將石油烴礦化成二氧化碳和水。當(dāng)二氧化碳和水釋放到空氣和水中時，生物載體的吸附能力又可以恢復(fù)。結(jié)果，兩個階段的協(xié)同作用形成了短暫的動態(tài)平衡，這與Wang等提出的吸附-協(xié)同生物降解模型一致[15]。

3 結(jié)論

(1)乙酸改性苧麻纖維固定菌比游離菌群對原油去除率更高，7 d后，固定化菌的生物去除率為85.16%。

(2)SEM及FTIR分析顯示，乙酸改性的苧麻纖維原始結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，具有良好的疏水性，增強了對石油烴污染物的吸附。改性載體具有良好的生物親和性，且細(xì)菌自身產(chǎn)生的胞外聚合物增強了對載體材料的粘附。

(3)在不同的環(huán)境因素(溫度、pH、鹽度)，固定化菌比游離菌表現(xiàn)出更好的環(huán)境耐受性。GC-FID顯示，固定化菌對烷烴的降解遠(yuǎn)高于游離菌群，特別是鏈長(C12～C20)的短鏈烷烴降解率高達(dá)94.85%。

(4)提出的吸附-協(xié)同生物降解假設(shè)模型，充分說明乙酸改性苧麻纖維吸附固定微生物去除原油是一種很有前途的油污修復(fù)方法。