郝培彤，寧亞明，高秋，劉芳，李玉龍，張尚雄，鄭桂亮，王顯國*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)系，北京 100193；2.全國畜牧總站，北京 100125；3.天津市飼草飼料工作站，天津 300210)

紫花苜蓿(Medicagosativa) 被譽為“牧草之王”，具有生物固氮能力，其根系十分發(fā)達(dá)可減少地表徑流，具很強的水土保持和防風(fēng)固沙能力，《全國苜蓿產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃 (2016-2020年)》提出到 2020 年全國優(yōu)質(zhì)苜蓿產(chǎn)量達(dá)到5.4×106t[1]?？茽柷呱车貣|起吉林省雙遼縣，西至內(nèi)蒙古赤峰市翁牛特旗，南北介于燕山北部黃土丘陵和大興安嶺東麓丘陵，地跨內(nèi)蒙古、吉林、遼寧3個省區(qū)，總面積大約5.17×104km2，為我國北方重要的農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)基地。近年來，隨著以奶業(yè)為龍頭的草食家畜業(yè)迅猛發(fā)展，依托較好的自然條件、政策與區(qū)位優(yōu)勢，本區(qū)苜蓿生產(chǎn)得到了快速的發(fā)展，現(xiàn)已成為我國機械化程度最高、集中連片生產(chǎn)面積最大的新興苜蓿優(yōu)勢產(chǎn)區(qū)，其中核心產(chǎn)地-赤峰市阿魯科爾沁旗現(xiàn)有具備噴灌設(shè)施的紫花苜蓿生產(chǎn)基地5×104hm2。

紫花苜蓿作為多年生牧草，越冬能力是影響其翌年產(chǎn)量的重要因素，阿旗地區(qū)晝夜溫差大，以2月為例 (近7年數(shù)據(jù))，白天溫度可達(dá)10 ℃、夜間-25 ℃，土壤不斷地發(fā)生凍融交替，加之該地區(qū)冬季干旱降水少極易導(dǎo)致地表附近的根頸脫水死亡喪失再生能力。冬季干旱造成的苜蓿非正常死亡主要表現(xiàn)為植株根頸部位失水收縮，較嚴(yán)重的根頸出現(xiàn)黑斑壞死甚至整個根部呈干枯狀，一旦根頸受凍產(chǎn)生黑斑甚至變黑、腐爛時便不會返青，對越冬率及翌年的生長產(chǎn)生影響[2]。

秋眠級可以作為判斷苜蓿抗寒性的依據(jù)，不同秋眠級苜蓿根頸特性差異顯著[3]。王龍昌等[4]研究指出不同苜蓿品種越冬期間根頸直徑、枝條再生數(shù)及越冬后產(chǎn)量都與土壤含水量呈正相關(guān)。方強恩[5]研究表明紫花苜蓿根頸芽細(xì)胞在越冬期間會發(fā)生一系列適應(yīng)低溫的變化提高根頸芽的抗寒能力。研究表明抗寒鍛煉可顯著提高紫花苜蓿的抗寒性[6]，秋眠性紫花苜蓿品種Evolution經(jīng)抗寒鍛煉后可顯著提高根頸可溶性糖含量，其中蔗糖、棉子糖、水蘇糖類寡糖等含量顯著增加[7]。此外越冬期間可溶性蛋白、氨基酸、活性氧清除酶等都會發(fā)生一系列適應(yīng)低溫的變化，Sambe等[8]研究表明抗寒性與冷誘導(dǎo)蛋白的積累成正相關(guān)，增強細(xì)胞抗結(jié)冰脫水能力維持細(xì)胞膜穩(wěn)定進(jìn)而提高抗寒性和抗凍性[9]。但目前關(guān)于越冬期間水分不同引起的干旱造成根頸脫水死亡影響返青的機制研究未見報道，由于田間不可控因素多，易受氣候、風(fēng)速、溫度等因素的影響且不同地塊苜蓿根頸失水程度不同，故本試驗采取室內(nèi)模擬越冬期間不同水分的低溫鍛煉過程，探究低溫下根頸各形態(tài)、生理指標(biāo)與水分之間的關(guān)系以期揭示苜蓿根頸的耐脫水機理，為科爾沁沙地地區(qū)紫花苜蓿冬春季越冬技術(shù)及當(dāng)?shù)剡m宜品種的篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2017年6月4日在中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院溫室用花盆種植不同秋眠級的苜蓿品種(具體品種及秋眠級見表1)，每品種各21盆，花盆規(guī)格為：上口徑16 cm，下口徑9.5 cm，高23 cm，種植基質(zhì)為內(nèi)蒙阿旗地區(qū)原生沙土，每盆保證出苗10株，出苗后進(jìn)行正常田間管理澆水、除草等，每14 d澆灌一次營養(yǎng)液，溫室溫度控制在25～30 ℃，為保證苜蓿具有較強的生長能力，在正式低溫試驗之前，每35 d對苜蓿進(jìn)行一次刈割以促進(jìn)根系的生長發(fā)育。于2017年11月15日將試驗材料刈割至8 cm并從溫室移至人工氣候室并于20 ℃條件下生長3 d，于2017年11月19日開始人工模擬越冬處理，在開始抗寒鍛煉之前在花盆底部及外圍包裹保溫材料，先包裹長51 cm×寬23 cm×厚15 mm帶背膠的橡塑海綿，再包裹3層長53 cm×寬30 cm×厚5 mm的毛氈布，包裹完成后開始模擬越冬試驗。

1.2 試驗方法

模擬越冬過程分以下階段進(jìn)行：1)抗寒鍛煉期： 第1階段將花盆置于白天10 ℃(14 h，光強為7000 Lx)，夜間5 ℃(10 h)的低溫氣候室生長7 d，第2階段調(diào)整溫度為白天5 ℃ (14 h，光強為7000 Lx)，夜間2 ℃(10 h)并生長7 d。整個抗寒鍛煉過程保持土壤含水量為田間持水量的90%～95%，抗寒鍛煉期結(jié)束后對每盆材料進(jìn)行換土，換土深度為從表土至根頸處3 cm。換土：替換土壤的含水量為田間持水量的40%(N1)、田間持水量的65%(N2)、田間持水量的90%(N3)，每個處理7次重復(fù)，換土之后轉(zhuǎn)入抗寒冰凍期的培養(yǎng)。2)抗寒冰凍期：白天-10 ℃ (8 h，光強為2000 Lx)，夜間-10 ℃ (16 h) 并生長3 d。3)凍融交替期：光照時間為8 h，光強為3000 Lx，并于10:00-13:00設(shè)置溫度為4 ℃，其余時間溫度為-10 ℃，生長3 d。4)緩苗期： 白天4 ℃(8 h，光強為3000 Lx)，夜間4 ℃(16 h)條件下緩苗3 d。 緩苗期結(jié)束后，一部分材料用于越冬指標(biāo)的測定，一部分送回溫室，在溫室條件下進(jìn)行返青。送回溫室后，各試驗材料恢復(fù)正常供水即為田間持水量的75%～80%。

表1 供試品種Table 1 The experiment materials

注：數(shù)據(jù)來自北京正道生態(tài)科技有限公司、克勞沃有限公司和北京佰清源畜牧業(yè)科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品宣傳冊?！?”表示抗寒級數(shù)未知。

Note: The data are from the brochures of Beijing Rytway seed Company Limited, Clover Company Limited and Beijing Green Animal Husbandry S&T Development Company Limited. “-”means the cold resistance is unknown.

1.3 指標(biāo)測定

迅速剪取經(jīng)不同水分條件越冬并緩苗之后的各試驗材料根頸處 1 cm，立即用冷水沖洗并測定根頸水勢，其余根頸迅速用液氮保存并存至-80 ℃冰箱，用于后續(xù)指標(biāo)的測定。剩余材料去除花盆外部保溫裝置后送回溫室進(jìn)行返青觀測并于14 d后測定返青率及地上部鮮重和干重。用游標(biāo)卡尺測量根頸直徑，根頸收縮處直徑X1與最膨大處直徑X2，根頸收縮比=(X2-X1)/X2×100%；采用1505D-EXP(Model 1505D Pressure Chamber Instrument，美國)氣穴壓力勢植物水勢儀測定根頸水勢；采用蒽酮硫酸比色法測定可溶性糖、淀粉含量[11-12]；采用酸性茚三酮比色法測定游離脯氨酸含量[13]；采用戴安ICS 3000離子色譜儀(DIONEX ICS-3000，美國) 與安培檢測器測定根頸蔗糖、棉子糖、水蘇糖、果糖、甘露糖和半乳糖含量。

越冬后返青指標(biāo)的測定，返青后統(tǒng)計每個處理苜蓿苗的返青率、返青枝條數(shù)、返青地上部鮮重及經(jīng)105 ℃殺青15 min，65 ℃烘干至恒重的地上部干重。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用 SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件整理并對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用兩因素和 One-way ANOVA 進(jìn)行方差分析，用Duncan法多重比較，并用 Excel 2013 制作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同水分條件越冬對各品種根頸收縮水勢、可溶性糖含量及淀粉含量的影響

除WL363外，其余品種的根頸收縮比在N1、N2水分下越冬時差異不顯著，但都顯著高于 (P<0.05) N3條件下的根頸收縮比(圖1)。N1水分下騎士T根頸收縮程度最小，為12.26%。N2水分下WL363、巨能4015根頸收縮明顯。N3水分下各供試品種根頸收縮差異均不顯著，WL168根頸收縮最小為5.18%。各品種在N3水分下越冬時根頸水勢顯著高于(P<0.05)N2和N1水分條件，N3水分條件下WL298根頸水勢顯著低于其他(圖1)。N2、N1水分下騎士T根頸水勢顯著高于其他(P<0.05)。除WL363外其余供試品種根頸可溶性糖含量隨水分的增加呈上升趨勢，抗寒級數(shù)較大的WL168、WL298、公農(nóng)一號、騎士T在不同水分下越冬后根頸可溶性糖含量之間差異不顯著，而抗寒級數(shù)較小的WL363、巨能4015均表現(xiàn)為N1水分顯著降低可溶性糖含量(P<0.05)。根頸淀粉隨越冬水分增加呈下降趨勢。N1水分下，抗寒級數(shù)較大的WL298淀粉顯著低于 (P<0.05)其他，而抗寒級數(shù)較大的WL168淀粉含量為供試品種最大值。N2水分下抗寒級數(shù)較小的巨能4015根頸淀粉最少。N3水分下WL298淀粉含量最少(圖1)。

圖1 各品種在不同水分條件下越冬對根頸收縮、水勢、可溶性糖及淀粉的影響Fig.1 Effect of different moisture treatments on crown contraction, water potential, soluble sugar and starch during the winter of different varieties A:WL363；B:巨能4015 Magnum 4015；C:騎士T Knight T；D:公農(nóng)一號Gongnong No.1；E:WL298；F:WL168.不同小寫字母表示同水分不同材料差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示同材料不同水分差異顯著 (P<0.05)，下同。The different lowercase letters indicate significant differences in moisture at different materials (P<0.05); The different capital letters indicate that the same material is significantly different under different moisture levels (P<0.05), the same below.

2.2 不同水分越冬對各品種根頸糖分的影響

由圖2可以看出，可溶性糖中蔗糖所占比例最大，最高達(dá)85%。各品種中，根頸蔗糖含量隨越冬水分增加呈上升趨勢，N3水分條件下WL363蔗糖含量最大，騎士T、WL298次之。N2水分條件下各品種蔗糖與N3比均顯著降低。棉子糖含量隨越冬期間水分含量增加呈上升趨勢，N3水分條件下抗寒級數(shù)較大的WL298、WL168棉子糖含量顯著高于(P<0.05)其他。對于抗寒級數(shù)較小的巨能4015，N1、N2水分條件下顯著降低其根頸棉子糖含量(P<0.05)。水蘇糖隨越冬期間根頸水分增加呈上升趨勢，抗寒級數(shù)較大的WL298在各水分條件下水蘇糖含量均表現(xiàn)較好，N3水分條件下水蘇糖含量最大。N1水分條件下WL298、WL168的水蘇糖含量較高。騎士T、公農(nóng)一號、WL298 和WL168 根頸中的果糖含量隨越冬期間土壤水分含量的增加呈先上升后降低的趨勢，抗寒級數(shù)較小的WL363、巨能4015則表現(xiàn)為隨土壤水分含量的增加果糖含量呈下降趨勢。除巨能4015、騎士T外，根頸甘露糖含量隨土壤水分含量的增加呈上升趨勢。N2水分條件下巨能4015、騎士T具有較高的甘露糖含量，且顯著高于其他各品種(P<0.05)。根頸半乳糖含量隨越冬期間土壤水分含量的增加呈上升趨勢，N3水分條件下騎士T品種的根頸半乳糖含量最高。

2.3 不同水分越冬對各品種根頸脯氨酸含量及相對電導(dǎo)率的影響

越冬期間根頸脯氨酸含量隨根頸水分增加呈上升趨勢(圖3)，且N3水分條件下各品種脯氨酸含量顯著高于N2、N1條件(P<0.05)。N3水分條件下抗寒級數(shù)較大的WL298、WL168脯氨酸含量顯著高于其他(P<0.05)。隨著越冬水分增加根頸相對電導(dǎo)率呈下降趨勢，抗寒級數(shù)較大的WL168在N3水分條件下根頸相對電導(dǎo)率顯著低于N1、N2(P<0.05)，隨水分增加電導(dǎo)率下降幅度分別為為5.9%和14.7%。對于抗寒級數(shù)較小的WL363而言，各水分處理間根頸的相對電導(dǎo)率差異不顯著。

圖2 不同水分條件下越冬對各品種根頸糖分的影響Fig.2 Effect of different moisture treatments on crown sugars during the winter of different varieties

圖3 不同水分越冬對各品種根頸脯氨酸含量和相對電導(dǎo)率的影響Fig.3 Effect of different moisture treatments on crown proline and relative conductivity during the winter of different varieties

2.4 不同水分越冬對各品種返青性能的影響

隨越冬期間土壤水分含量的增加返青率呈上升趨勢，抗寒級數(shù)較大的WL168在各水分條件下返青率都表現(xiàn)較好，WL363、巨能4015的返青率次之，平均達(dá)73.17%。N2水分條件下WL363返青率最高達(dá)66.67%，騎士T返青最差僅35.33%。N1水分條件下WL298、WL168返青率顯著高于其他(P<0.05)(圖4)。此外，隨著越冬期間土壤水分含量的增加，返青苜蓿的枝條數(shù)呈上升趨勢，N3水分條件下各品種苜蓿的返青枝條數(shù)顯著高于其他水分條件(P<0.05)，騎士T的返青枝條數(shù)最高。N1水分條件下巨能4015、騎士T和公農(nóng)一號的返青枝條數(shù)都顯著低于WL298、WL168(P<0.05)。返青后地上部鮮重隨土壤水分含量的增加呈上升趨勢，N3水分條件下WL298品種的地上部鮮重顯著高于其他品種(P<0.05)，WL363、巨能4015的地上部鮮重最小，平均為11.71 g。N1水分條件下WL168鮮重表現(xiàn)最好，巨能4015在N1水分條件下鮮重最少，顯著低于其他各品種(P<0.05)。返青后地上部干重隨越冬期間土壤水分含量的增加呈上升趨勢，N3水分條件下WL363、巨能4015的干重顯著低于其他品種(P<0.05)，N2水分條件下WL298、WL168的干重較大，但各品種間差異不顯著。N1水分下WL298干重顯著高于其他品種(P<0.05)，而WL168的干重最低。

圖4 不同水分越冬后各品種返青性能Fig.4 Effect of different moisture treatments on regrowth performance during the winter of different varieties

3 討論

越冬期間干旱會造成苜蓿根頸部位失水收縮，劉志英[14]研究結(jié)果標(biāo)明越冬期間秋眠級低抗寒級數(shù)大的苜蓿根頸直徑較大，說明抗寒性強與苜蓿的根頸性狀有一定的關(guān)系，而本試驗結(jié)果表明秋眠性低抗寒級數(shù)較大的WL168、騎士T、公農(nóng)一號、WL298根頸收縮都顯著低于秋眠性高的WL363和巨能4015，這再次證明根頸的性狀與苜蓿的抗寒性有關(guān)。王運濤[15]研究結(jié)果表明秋眠級較低苜蓿根頸粗壯表現(xiàn)出更強的越冬率，越冬期間根頸入土較深，根頸周圍分布較多的根頸芽及分枝本研究中，抗寒性較強的WL168的分枝數(shù)在越冬后也較多，本研究結(jié)果與此一致。水勢反映植物的水分狀況，韓文軍等[16]對阿拉善荒漠區(qū)鹽生植物的日水勢研究表明植物在水分脅迫下通過水勢變化可反映植物體含水量的多少，從而更好地探討植物耐逆境脅迫的機理，本試驗各品種N3水分下越冬時根頸水勢顯著高于N1和N2條件，說明越冬期間尤其是冰凍期水分顯著影響不同秋眠品種根頸的水勢，水勢越低越易造成根頸的失水干枯死亡，從而導(dǎo)致返青率降低，本試驗結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)在冰凍期，40%的田間持水量可顯著降低根頸水勢，結(jié)合返青率和分枝數(shù)的數(shù)據(jù)可以看出，田間含水量越低，其返青率和枝條數(shù)也越低，說明越冬期內(nèi)土壤水分含量影響著苜蓿的生長情況，即在越冬季應(yīng)注意苜蓿地水分的補充。而結(jié)合水勢與根頸收縮比的結(jié)果可以看出，同品種不同水分處理條件下，土壤水分含量越低，根頸收縮比越高，根頸水勢也越低，由此可以看出土壤水分含量主要通過影響根頸的活性，進(jìn)而影響苜蓿的生長情況。

越冬期間可溶性碳水化合物作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)通過增加細(xì)胞液濃度降低冰點，緩沖細(xì)胞質(zhì)的脫水避免蛋白質(zhì)凝固變性，增強植物抗凍性。本試驗通過對糖分的測定表明可溶性總糖中蔗糖含量最高且在不同水分條件下越冬下各品種差異顯著，對于秋眠性低抗寒級數(shù)較大的WL298、WL168而言蔗糖含量顯著增加，而WL363品種的蔗糖也出現(xiàn)較高含量的積累，可能是因為WL363相對來說仍屬于秋眠性品種 (Fall Dormancy 4.9)，高水分下越冬仍會促進(jìn)根頸積累蔗糖從而提高越冬能力。韓文軍等[16]、Jung等[17]、Castonguay等[18]的研究結(jié)果也表明可溶性碳水化合物的最主要部分是蔗糖，蔗糖的含量與苜蓿的抗寒性有一定的相關(guān)性。本試驗中不同秋眠級苜蓿根頸可溶性糖含量隨越冬水分增加而增加，對于抗寒級數(shù)較小的WL363、巨能4015根頸可溶性糖增加的更明顯，對于抗寒級數(shù)較大的WL168、騎士T、公農(nóng)一號、WL298品種，根頸可溶性糖含量隨水分增加而增加但相互間差異不顯著，說明這4個品種越冬期間糖分積累量較高而消耗的較少，表明這4個品種具有更強的抗寒性。Haagenson等[19]研究結(jié)果也表明秋眠性低抗寒級數(shù)越大的品種所積累的可溶性碳水化合物越多。Castonguay等[18]研究結(jié)果表明淀粉在越冬期間可轉(zhuǎn)化成可溶性糖，從而提高苜蓿的抗寒性，本試驗結(jié)果表明隨著越冬期間土壤水分條件的增加，根頸中的淀粉含量呈下降趨勢，而可溶性糖含量升高。Castonguay等[18]研究表明諸如棉子糖、水蘇糖類的寡糖積累與苜蓿的抗寒性相關(guān)，本研究結(jié)果也表明，根頸中棉子糖、水蘇糖類和寡糖的含量隨越冬期間土壤水分含量的增加而增加，其中抗寒性較強的WL298、WL168、WL363苜蓿品種的增加量較大，而騎士T和巨能4015的棉子糖、水蘇糖類和寡糖積累量相對較少。

脯氨酸是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，Jaleel等[20]研究表明干旱脅迫下，植物通過調(diào)節(jié)和特化氣孔結(jié)構(gòu)來增強保水能力，通過促進(jìn)根系生長、積累脯氨酸和可溶性糖等物質(zhì)提高滲透調(diào)節(jié)能力，通過抗氧化劑和活性氧清除酶來降低活性氧傷害。本研究結(jié)果表明N3條件下WL168、WL298、WL363積累的脯氨酸最多，而干旱條件顯著降低各秋眠品種的脯氨酸含量，這與Dhont等[21]的研究結(jié)果相似，說明脯氨酸可能對越冬時水分影響較敏感，水分降低會導(dǎo)致各品種脯氨酸的降低影響根頸抗寒性和苜?？箖鲂?。Sule等[22]研究表明，抗寒性強的苜蓿品種細(xì)胞內(nèi)溶物泄漏率低，冷凍對其造成的傷害較小。本研究結(jié)果表明，相對電導(dǎo)率隨越冬水分增加呈下降趨勢，說明抗寒級數(shù)較大的品種受離子脅迫程度小，抗寒級數(shù)較小的WL363、巨能4015各處理間相對電導(dǎo)率差異不顯著，抗寒級數(shù)較小的品種受水分影響較大，這與它們本身的秋眠性相對較高有關(guān)。

越冬后的返青率及返青枝條再生數(shù)、返青后株高、鮮重、干重等都能代表一個品種越冬率及抗寒性的強弱。因此對越冬后的返青數(shù)據(jù)采集能更全面地反映一個品種的抗寒性，本研究結(jié)果顯示返青率與秋眠性相關(guān)，秋眠性越低抗寒級數(shù)越大的品種返青率越高。返青枝條數(shù)隨越冬水分增加顯著增加，說明越冬期間水分對返青率產(chǎn)生影響，相比于抗寒級數(shù)較大的WL298、WL168品種，巨能4015返青率及返青枝條數(shù)、鮮重都顯著受到抑制，說明品種的抗寒級數(shù)還是影響越冬及產(chǎn)量的因素之一，WL363雖秋眠性也高但可能由于越冬期間積累較多的脯氨酸、蔗糖、棉子糖等表現(xiàn)出較高的返青率及枝條數(shù)，也可能是由于打破越冬休眠后刺激WL363根頸促進(jìn)再生枝條的萌發(fā)和生長，也有可能是 WL363 再生節(jié)點低、再生性強越冬恢復(fù)性較強，有待進(jìn)一步開展試驗進(jìn)行探究驗證。孫予璐等[23]研究結(jié)果表明抗寒性強的品種低溫脅迫下積累較高的可溶性糖從而提高苜蓿的抗寒性，而本試驗也證實抗寒級數(shù)較大的 WL298、WL168 經(jīng)不同水分越冬并返青后返青率及返青枝條數(shù)、返青后干鮮重均表現(xiàn)最佳，說明 WL298、WL168 根頸耐脫水較強，即在較低的水分條件下根頸也能完成越冬保護(hù)性糖的生理進(jìn)程，減少越冬傷害。

4 結(jié)論

1)模擬越冬季不同水分顯著影響各品種根頸越冬保護(hù)性糖的積累及根頸的生理活性，尤其是蔗糖、棉子糖、水蘇糖類寡糖及果糖的積累。

2)抗寒級數(shù)較大的WL298、WL168根頸耐脫水較強。騎士T、公農(nóng)一號根頸耐脫水性中等。而抗寒級數(shù)較小的巨能4015根頸耐脫水性較弱。WL363雖秋眠級高但由于積累越冬保護(hù)性糖的含量高、根頸耐脫水能力及再生恢復(fù)性較強表現(xiàn)出較強的越冬能力，根頸耐脫水性中等。

3)越冬水分維持在田間持水量90%時，WL298、WL168、騎士T、公農(nóng)一號的越冬保護(hù)性糖及返青后生產(chǎn)性能均強于巨能4015。越冬水分維持在田間持水量40%及以下各品種根頸收縮程度顯著增加，WL298、WL168、WL363返青性能較好而騎士T、公農(nóng)一號和巨能4015則返青率相對較低。