陳 晨 徐德平 金 蒙 張曉娟

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

核桃(JuglansregiaL)又名胡桃、羌桃。中醫(yī)認(rèn)為，核桃具有健腦益智，補(bǔ)腎固精，溫肺定喘的作用[1]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，核桃還具有抗氧化[2-3]，調(diào)節(jié)膽固醇，降低血壓，預(yù)防心腦血管疾病的功效[4-5]，是公認(rèn)的“黃金圣果”。

有關(guān)核桃生理功能的研究報(bào)道較多，相對應(yīng)的功效成分報(bào)道卻較少，如核桃具有抗心腦血管疾病的功能，大量文獻(xiàn)[6-7]表明是核桃油中不飽和脂肪酸起主要作用，但李旭[8]以大鼠高血壓為模型，對比脫脂核桃粉和核桃油的作用效果，發(fā)現(xiàn)脫脂核桃粉的降血壓效果明顯優(yōu)于核桃油，說明脫脂核桃仁中含有抗心腦血管疾病的成分，而有關(guān)此成分的研究尚未見報(bào)道。

試驗(yàn)擬以脫脂核桃仁為原料，采用多種色譜法分離，通過細(xì)胞體外功能評價(jià)來尋找核桃中抗心血管疾病的功能成分，旨在明確核桃仁中除油以外預(yù)防心血管疾病作用的功效成分，以期為核桃資源的高效利用和深加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

脫脂核桃仁：云南省林業(yè)科學(xué)院；

SD乳鼠：上海實(shí)驗(yàn)動物研究中心。

無水乙醇、正丁醇、茴香醛、冰醋酸、甲醇、硫酸：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

MMT母液：美國Sigma公司；

大孔吸附樹脂AB-8型：天津南開大學(xué)化學(xué)工廠；

MCI填料(100 μm)、ODS-D填料(50 μm)：日本三菱化學(xué)公司；

乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)試劑盒：上海銘博生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

雙層玻璃提取罐：RAT-100D型，無錫申科儀器有限公司；

真空泵：MP-201型，鄭州長城科工貿(mào)易有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：R-501型，鄭州華特儀器設(shè)備有限公司；

CO2培養(yǎng)箱：PYC-30型、96孔板，上海化科實(shí)驗(yàn)器材有限公司；

高壓滅菌鍋：LDZX-75KBS型，蘇州賽恩斯儀器有限公司；

倒置顯微鏡：XDS1C型，上海萬衡精密光學(xué)儀器廠；

冷凍高速離心機(jī)：Eppendorf 5810R型，德國 Eppendorf公司；

色譜儀：WATERS 2690型，美國沃特世公司；

紫外檢測器：WATERS 996型，美國沃特世公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 核桃功能成分的提取 取20 kg脫脂核桃仁，粉碎后過30目篩，每次取10 kg放入提取罐中，按料液比1∶10(g/mL)加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇，于70 ℃，120 r/min攪拌提取2 h，過濾，濾渣重復(fù)提取兩次，合并濾液，于70 ℃減壓濃縮成浸膏，得 1.82 kg乙醇提取物，冷藏備用。取1.0 kg乙醇提取物，加水溶解至1 L，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用1 L乙酸乙酯萃取，重復(fù)操作4次，將乙酸乙酯相合并于50 ℃減壓濃縮至干，得核桃乙酸乙酯萃取物173.1 g。

1.2.2 乙酸乙酯萃取物的分離 取1.2.1中全部乙酸乙酯萃取物，溶解于適量去離子水中，上大孔樹脂柱AB-8(10 cm×150 cm)，依次用體積分?jǐn)?shù)為30%，50%，70%乙醇洗脫，每梯度洗脫2 000 mL。將各部分洗脫液減壓濃縮，得30%乙醇洗脫物49.7 g，50%乙醇洗脫物38.2 g，70%乙醇洗脫物32.1 g。

1.2.3 大孔樹脂柱分離組分的抗心肌細(xì)胞缺血活性的測定 取20只新生乳鼠，參照文獻(xiàn)[9]的方法制備心肌細(xì)胞，平均分為正常對照組、缺血/再灌注模型組與體積分?jǐn)?shù)30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇洗脫物試驗(yàn)組。

(1) 心肌細(xì)胞存活率的測定：按照文獻(xiàn)[10]配制模擬缺血液。先向缺血液中充入95% N2與5% CO2飽和15 min，置換正常培養(yǎng)基，放入自制密封盒內(nèi)，再通入95% N2與5% CO2，直至充分排盡盒中原有氣體，密封，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，造成心肌細(xì)胞缺血缺氧。再灌注時(shí)以復(fù)氧血液置換缺血液，通入95% O2與5% CO2，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。采用MTT法[11]測定心肌細(xì)胞存活率。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，經(jīng)缺血/再灌注和藥液干預(yù)后，吸出培養(yǎng)液，細(xì)胞用磷酸緩沖液輕輕漂洗3次，再向每孔中加入100 μL含有0.5 g/L MTT母液的溶液，培養(yǎng)4 h，再次吸培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移至暗處操作，依次向每孔中加入二甲基亞砜(DMSO)溶液150 μL，低速振蕩10 min，于酶標(biāo)儀中測吸光度。

(2) 心肌細(xì)胞受損程度的測定：采用試劑盒測定心肌細(xì)胞酶水平，取每孔內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，參照說明書操作，比色法檢測細(xì)胞上清中LDH、CK的含量。

1.2.4 大孔樹脂柱分離的具有抗心肌缺血活性組分的分離 取大孔樹脂分離的具有抗心肌缺血活性的50%乙醇洗脫物35 g，用適量去離子水溶解，上MCI Gel柱(5 cm×100 cm，100 μm)，依次用500 mL去離子水清洗，體積分?jǐn)?shù)為45%，50%，55%的乙醇各500 mL梯度洗脫，每梯度收集25支試管，20 mL為一試管。洗脫液經(jīng)薄層色譜(TLC)鑒定，用硫酸茴香醛染色，相同Rf值和顯色情況的洗脫液合并，分別得45%，50%，55%的乙醇洗脫物6.5，10.4，5.2 g。

1.2.5 MCI Gel柱分離組分的抗心肌缺血活性檢測 按1.2.3的方法對MCI Gel柱分離得到的45%，50%，55%的乙醇洗脫物抗心肌缺血活性進(jìn)行檢測。

1.2.6 抗心肌缺血活性組分分析 采用高效液相色譜(HPLC)對MCI Gel柱分離得到的具有抗心肌缺血活性組分的洗脫物的化學(xué)組成進(jìn)行分析。色譜條件：色譜柱Symetry C18色譜柱(2.1 mm×150 mm，5 μm)；流動相：0 min，100%水(含0.2%甲酸)；20 min后，50%甲醇+50%水(含0.2%甲酸)；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；紫外檢測器波長260 nm。

1.2.7 抗心肌缺血活性單體化合物純化與結(jié)構(gòu)鑒定 取MCI Gel柱45%的乙醇洗脫物5.8 g溶于適量去離子水中，上樣至ODS柱(3.5 cm×100 cm，50 μm)，依次用體積分?jǐn)?shù)40%，45%，50%乙醇梯度洗脫，得兩個(gè)純的單體化合物Ⅰ、Ⅱ，分別為153.1，82.3 mg。將Ⅰ、Ⅱ用二甲亞砜(DMSO)溶解后進(jìn)行1H-NMR、13C-NMR測定。

1.2.8 單體化合物的抗心肌缺血活性作用研究 參照文獻(xiàn)[9]的方法制備心肌細(xì)胞，平均分為10組：正常對照組、缺血/再灌注模型組、試驗(yàn)組(8組)。對照組為正常培養(yǎng)細(xì)胞，模型組經(jīng)缺血再灌注過程，試驗(yàn)組經(jīng)缺血再灌注過程后再分別灌注單體化合物Ⅰ、Ⅱ，劑量為50，100，150，200 mg/L。心肌細(xì)胞存活率及細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH、CK含量測定方法同1.2.3。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂柱分離組分的抗心肌細(xì)胞缺血活性

由表1可知，各試驗(yàn)組中，體積分?jǐn)?shù)50%乙醇試驗(yàn)組的乳鼠心肌細(xì)胞存活率最大，LDH和CK酶含量最低，表現(xiàn)出的抗心肌缺血活性最強(qiáng)，且與模型小鼠存在顯著性差異(P<0.01)。而體積分?jǐn)?shù)30%，70%乙醇試驗(yàn)組的細(xì)胞存活率、LDH和CK酶含量與模型組相比均無明顯差異，說明不含抗心肌缺血活性成分。由此推斷核桃乙醇提取物乙酸乙酯萃取物有抗心肌缺血活性，且有效成分位于體積分?jǐn)?shù)50%乙醇洗脫物中，故對體積分?jǐn)?shù)50%乙醇洗脫物進(jìn)一步分離。

2.2 MCI Gel柱分離組分的抗心肌細(xì)胞缺血活性

由表2可知，各試驗(yàn)組中，體積分?jǐn)?shù)45%乙醇洗脫物作用后的乳鼠心肌細(xì)胞存活率最大，LDH和CK酶含量最低，表現(xiàn)出的抗心肌缺血活性最強(qiáng)，且與模型小鼠存在顯著性差異(P<0.01)。而體積分?jǐn)?shù)50%，55%乙醇洗脫物作用后，細(xì)胞存活率、LDH和CK酶含量與模型組相比均無明顯變化，說明不含抗心肌缺血活性成分。由此推斷經(jīng)MCI Gel柱分離的45%乙醇洗脫物有抗心肌缺血活性，故對體積分?jǐn)?shù)45%乙醇洗脫物進(jìn)行成分分析和分離純化。

表1 大孔樹脂柱分離組分對缺血/再灌注心肌細(xì)胞存活率及LDH、CK酶含量的影響?Table 1 Effects of separation of different components on macroporous resin column on myocardial cell survival rate and LDH and CK enzyme contents in ischemia/reperfusion

? # 表示與缺血/再灌注模型組比較差異顯著(P<0.01)。

表2 MCI Gel柱分離組分對缺血/再灌注心肌細(xì)胞存活率及LDH、CK酶含量的影響?Table 2 Effects of MCI Gel column separation components on myocardial cell survival rate and LDH and CK enzyme contents in ischemia/reperfusion

? # 表示與缺血/再灌注模型組比較差異顯著(P<0.01)。

2.3 45%乙醇提取物組成成分

核桃抗心肌缺血活性成分存在于經(jīng)MCI Gel柱分離的45%乙醇洗脫物中，對該洗脫物進(jìn)行HPLC分析，由圖1可知，45%乙醇洗脫物主要由兩個(gè)峰組成，保留時(shí)間分別為1.56，1.94 min，推測該部分主要由兩個(gè)化合物組成。

圖1 45%乙醇洗脫物液相色譜圖Figure 1 45% ethanol eluate in HPLC

2.4 核桃中抗心肌缺血活性單體化合物的分離

將MCI Gel柱45%乙醇洗脫物反復(fù)上ODS柱，依次用40%，45%，50%乙醇洗脫，直到分離出該組分所含的兩個(gè)單體化合物Ⅰ、Ⅱ，化合物Ⅰ對應(yīng)保留時(shí)間為1.94 min，化合物Ⅱ?qū)?yīng)保留時(shí)間為1.56 min。由圖2可知，兩個(gè)化合物的薄層色譜圖均呈單一條帶。

圖2 單體化合物薄層色譜圖Figure 2 Thin layer chromatography of compound Ⅰ&Ⅱ

2.4.1 化合物Ⅰ的結(jié)構(gòu)鑒定 化合物Ⅰ為白色無定形粉末，溶于甲醇、乙醇，極易溶于水。ESI-MS得出m/z：178 [M+H]+，化合物Ⅰ分子量為177，表明含有奇數(shù)個(gè)N元素。

1H-NMR譜可知：δ3.72，2.80含兩個(gè)各為三分峰的亞甲基，偶合常數(shù)皆為6.9，表明兩個(gè)亞甲基相連；芳香區(qū)有4個(gè)氫信號，δ6.76(1H，dd，J=2.3，8.7)，δ6.99(1H，d，J=2.3)，δ7.23(1H，d，J=8.7)各含1個(gè)氫，由偶合常數(shù)可知，其構(gòu)成一個(gè)AMX系統(tǒng)，即苯環(huán)上三取代氫；δ6.78的氫為單峰氫。

13C-NMR譜中共10個(gè)碳：δ151.5為苯環(huán)上連氧碳，判斷有-OH基存在，δ127.4，115.4，114.4，105.8為4個(gè)-CH上的碳，δ134.5，130.7，113.9為3個(gè)季碳。δ64.8，30.4為2個(gè)-CH2上的碳，從δ64.8的化學(xué)位移來看-CH2上碳連有氧，推斷有-CH2CH2OH結(jié)構(gòu)片斷。綜合分析并參照文獻(xiàn)[12]得化合物Ⅰ為5,10-二羥色胺，其碳譜如圖3，結(jié)構(gòu)如圖4。

圖3 化合物Ⅰ碳譜圖Figure 3 Carbon spectrum of compound Ⅰ

圖4 化合物Ⅰ的結(jié)構(gòu)Figure 4 The chemical structures of compound Ⅰ

2.4.2 化合物Ⅱ的結(jié)構(gòu)鑒定 化合物Ⅱ?yàn)榘咨珶o定形粉末，溶于甲醇、乙醇，極易溶于水。ESI-MS得出m/z：203 [M+H]+，HR-ESI-MS得出m/z：203.274 7[M+H]+，對應(yīng)的分子式為C12H14N20。

1H-NMR譜顯示：1個(gè)雙峰甲基δ1.57(J=5.4)，δ4.60 處有1個(gè)四重峰質(zhì)子(J=5.4)，推測甲基與該質(zhì)子相偶合；δ2.83，3.61處各有2個(gè)質(zhì)子(-CH2)，皆呈三重峰(J=6.4)，表明-CH2相鄰；在低場區(qū)δ6.78(dd，J=2.4，8.7)，6.91(d，J=2.3)，7.27(d，J= 8.7)各有1個(gè)氫，從偶合常數(shù)來看，其構(gòu)成一個(gè)AMX系統(tǒng)，即苯環(huán)上三取代氫。

13C-NMR譜顯示該化合物共有12個(gè)碳：其中δ151.0 為苯環(huán)上連氧碳，判斷苯環(huán)上有-OH存在；δ114.4，114.0，104.7為苯環(huán)上的3個(gè)-CH上的碳；δ133.4，133.3，128.2，106.9為4個(gè)季碳；δ51.2為-CH上的碳，從化學(xué)位移來看該碳與N元素相連；δ43.1，19.8為兩個(gè)-CH2上的碳，結(jié)合氫譜來看兩個(gè)-CH2上碳相連；δ43.1的碳可能也與N元素相連，推斷有-CH2CH2N 結(jié)構(gòu)片斷；δ18.6為甲基。綜合分析1H-NMR、13C-NMR和MS的圖譜并參照文獻(xiàn)[13-14]得出化合物Ⅱ?yàn)镾hepherdine，其碳譜如圖5，結(jié)構(gòu)如圖6。

圖5 化合物Ⅱ碳譜圖Figure 5 Carbon spectrum of compound Ⅱ

圖6 化合物Ⅱ的結(jié)構(gòu)Figure 6 The chemical structures of compound Ⅱ

2.5 單體化合物的抗心肌缺血活性

由表3可知，模型組細(xì)胞存活率僅為26.45%，同時(shí)心肌細(xì)胞液中LDH、CK含量顯著升高，分別達(dá)到45.68%和22.76%，可見缺血/再灌注導(dǎo)致心肌細(xì)胞明顯損傷。5,10-二羥色胺劑量為50 mg/L時(shí)，細(xì)胞存活率為59.46%(P<0.05)、LDH和CK含量顯著降低(P<0.05)；5,10-二羥色胺劑量為150 mg/L時(shí)，心肌細(xì)胞存活率高達(dá)87.79%(P<0.01)，LDH、CK含量達(dá)到最低(P<0.01)，且呈劑量依賴關(guān)系；在200 mg/L時(shí)，心肌細(xì)胞存活率有所下降。表明5,10-二羥色胺對缺血/再灌注造成的心肌細(xì)胞損傷具有有效保護(hù)作用，150 mg/L時(shí)作用效果最佳。Shepherdine組細(xì)胞存活率與模型組相當(dāng)，隨著含量升高對缺血/再灌注損傷心肌細(xì)胞無明顯作用。

表3 化合物Ⅰ、Ⅱ?qū)θ毖?再灌注心肌細(xì)胞存活率及LDH、CK酶含量的影響?Table 3 Effects of compounds I and II on myocardial cell survival rate and LDH and CK enzyme content in Ischemia/Reperfusion

? * 表示與對照組比較差異顯著(P<0.05)；** 表示與對照組比較差異極顯著(P<0.01)；# 表示與缺血/再灌注模型組比較差異顯著(P<0.05)；## 表示與缺血/再灌注模型組比較差異極顯著(P<0.01)。

3 結(jié)論

試驗(yàn)利用乙醇提取，乙酸乙酯萃取，多種色譜法分離，采用乳鼠缺血再灌注損傷細(xì)胞模型篩選，從核桃中得到了血清素5,10-二羥色胺與Shepherdine兩個(gè)化合物，其中5,10-二羥色胺對心肌細(xì)胞損傷具有良好的保護(hù)作用，能夠提高細(xì)胞存活率，減少心肌細(xì)胞培養(yǎng)液上清中心肌酶(LDH、CK)的釋放，緩解心肌細(xì)胞損傷，表明5,10-二羥色胺是核桃仁中有益于心血管作用的功效成分，進(jìn)一步表明核桃預(yù)防心腦血管疾病作用除多不飽和脂肪酸外，5,10-二羥色胺也是重要的活性成分。

有關(guān)5,10-二羥色胺對心血管的作用已有較多的報(bào)道[15-16]，研究首次從核桃中分離鑒定出此成分，為核桃抗心血管疾病提供了新的思路。但該成分的量效關(guān)系和作用機(jī)制尚未明確，有待進(jìn)一步研究。