黃 坤 王會霞 范小龍 郭 嘉

(1. 湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北 武漢 430075；2. 湖北省食品質(zhì)量安全檢測工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430075；3. 綠色化工過程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430205)

紐甜屬于新型的強(qiáng)力功能性甜味劑，甜度約為蔗糖的12 000倍，其能量低、甜味柔和、無明顯異味，且高溫條件下穩(wěn)定性能十分優(yōu)異，因此被廣泛應(yīng)用于各類食品的生產(chǎn)過程中[1-4]，以改善口感和風(fēng)味。測量不確定度是指根據(jù)所用到的信息表征賦予被測量值分散性的非負(fù)參數(shù)，是與測量結(jié)果緊密相關(guān)的參數(shù)，因此完整的測量結(jié)果應(yīng)同時(shí)包含被測量值及其測量不確定度[5]。目前食品中紐甜含量的測定大多采用高效液相色譜法，關(guān)于其不確定度的評定較少[6-8]，而采用超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定結(jié)果的不確定度評定更少。為評估此方法的不確定度，研究擬參考相關(guān)文獻(xiàn)[9-11]，以已添加紐甜的市售葵花籽陽性樣品為例，對炒貨中紐甜的測定不確定度進(jìn)行分析評定，確定有關(guān)不確定度分量的貢獻(xiàn)，在實(shí)際檢測過程中可對重點(diǎn)過程進(jìn)行控制，以此保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確度和可信度，同時(shí)為其他甜味劑測定結(jié)果的不確定度評定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紐甜：≥98.0%，有效期至2020年4月，德國DR公司；

炒貨：實(shí)驗(yàn)室抽檢樣品，包括市售瓜子、堅(jiān)果和果仁等。

乙酸鋅、亞鐵氰化鉀：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

乙腈、甲醇、甲酸：色譜純，德國Merck公司；

超純水：電導(dǎo)率≤0.055 μS/cm，25 ℃，自制；

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀：TQS型，美國Waters公司；

電子天平：ME2002E和XS204型，梅物勒-托利多儀器(上海)有限公司；

翻轉(zhuǎn)混勻器：Trayster型，德國IKA公司；

超聲波清洗儀：P300H型，德國Elma公司；

高速離心機(jī)：Allegra X型，美國Beckman Coulter公司；

全自動固相萃取系統(tǒng)：Preval SPE 6S型，北京普立泰科儀器有限公司；

C18固相萃取柱：Sep-pak型(6 mL、500 mg)，美國Waters公司；

氮吹儀：N-EVAPTM112型，美國Organomation公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理 稱取樣品10 g左右置于50 mL離心管中，加入約30 mL水，翻轉(zhuǎn)混合0.5 min，于50 ℃水浴條件超聲處理10 min，冷卻后加乙酸鋅溶液和亞鐵氰化鉀溶液各2 mL，混勻，于4 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液至50 mL容量瓶中，用水定容至刻度，混勻后過濾待用。準(zhǔn)確移取10 mL濾液通過固相萃取柱，待液面降至柱床時(shí)，用5 mL水淋洗，棄去流出液，再用6 mL甲醇分兩次洗脫并收集凈化液至離心管中，于40 ℃水浴中氮吹至干，準(zhǔn)確移取2 mL初始比例流動相渦旋復(fù)溶0.5 min，過0.22 μm 微孔濾膜，續(xù)濾液視實(shí)際情況稀釋一定倍數(shù)后供超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。

1.3.2 液相色譜條件 C18色譜柱：50 mm×2.1 mm，1.7 μm；流動相：0.1%的甲酸水—乙腈，流速0.3 mL/min；梯度分析程序：0～0.3 min，乙腈5%；0.3～0.8 min，乙腈5%升至65%；0.8～3.2 min，乙腈65%升至95%；3.2～3.3 min，乙腈95%；3.3～3.4 min，乙腈95%降至5%；3.4～5.0 min，乙腈5%；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

1.3.3 質(zhì)譜參數(shù) 選擇ESI離子源負(fù)離子模式，電噴霧電壓2.50 kV，脫溶劑氣流量700 L/h，錐孔氣流量50 L/h，離子源溫度150 ℃，脫溶劑氣溫度350 ℃。多反應(yīng)監(jiān)測掃描(MRM)采集參數(shù)見表1。

表1 紐甜的質(zhì)譜采集參數(shù)?Table 1 Acquisition parameters ofneotame for UPLC-MS/MS

? *定量離子。

1.3.4 數(shù)學(xué)模型的建立 樣品中紐甜的含量按式(1)計(jì)算。

(1)

式中：

X——樣品中紐甜的含量，mg/kg；

C——樣品溶液的濃度，ng/mL；

V——樣品定容體積，mL；

m——樣品的稱樣質(zhì)量，g；

2 不確定度的評定與合成

2.1 不確定度來源分析

從式(1)結(jié)合實(shí)際測定過程可知，紐甜測定結(jié)果不確定度urel(X)的主要來源包括：① 樣品溶液濃度引入的不確定度urel(C)；② 樣品溶液定容及稀釋引入的不確定度urel(V)；③ 樣品稱樣過程引入的不確定度urel(m)；④ 測量重復(fù)性引入的不確定度urel(x)；⑤ 回收率引入的不確定度urel(R)。

2.2 不確定度評定

2.2.1 樣品稱樣過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(m)

其不確定度主要來源于重復(fù)性和天平的校準(zhǔn)。

試驗(yàn)中樣品的平均稱樣量為10.012 5 g，因此由樣品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.2 樣品溶液濃度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C)

其不確定度主要來源于標(biāo)準(zhǔn)溶液配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合。前者包括儲備液的配制、儲備液的稀釋和標(biāo)準(zhǔn)系列溶液制備3個(gè)過程。

(1) 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C1)：準(zhǔn)確稱取11.5 mg紐甜標(biāo)準(zhǔn)品(≥98.0%)，用超純水超聲溶解并定容至100 mL，即得濃度為112.7 μg/mL的紐甜標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

因此，由標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

(2) 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的稀釋引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C2)：用1 mL單標(biāo)線吸量管(A級)吸取標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液1 mL于100 mL單標(biāo)線容量瓶(A級)中，用超純水定容至刻度，混勻，即得濃度為1.127 μg/mL中間儲備液；用1 mL吸量管吸取中間儲備液1 mL于10 mL容量瓶中，即得濃度為112.7 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。采用矩形分布，各量具及溫度影響引入的不確定度見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液稀釋引入的不確定度Table 2 Uncertainty from the dilution of stock solution

故溶液稀釋引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

(3) 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C3)：用1 mL分度吸量管(A級)分別吸取標(biāo)準(zhǔn)使用溶液(112.700 ng/mL) 0.5，1.0 mL于10 mL單標(biāo)線容量瓶(A級)中，用超純水定容至刻度，搖勻，分別得到5.635，11.270 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；用2 mL單標(biāo)線吸量管(A級)吸取標(biāo)準(zhǔn)使用溶液2 mL于10 mL單標(biāo)線容量瓶(A級)中，用超純水定容至刻度，搖勻，即得22.540 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；用5 mL分度吸量管(A級)分別吸取標(biāo)準(zhǔn)使用溶液3，5 mL于10 mL單標(biāo)線容量瓶(A級)中，用超純水定容至刻度，搖勻，分別得到33.810，56.350 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；用10 mL分度吸量管(A級)吸取標(biāo)準(zhǔn)使用溶液8 mL于10 mL單標(biāo)線容量瓶(A級)中，用超純水定容至刻度，搖勻，即得90.160 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；直接將標(biāo)準(zhǔn)使用溶液作為112.700 ng/mL的工作溶液。

故由系列溶液配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

(4) 曲線擬合帶來的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C4)：分別取以上7種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液各進(jìn)樣1次，以系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度C對色譜峰面積作曲線，采用線性最小二乘法擬合得到回歸方程Y=A1C+A2(A1為斜率，A2為截距)，測定數(shù)據(jù)及計(jì)算結(jié)果如表4所示。由2.2.1、2.2.3和2.2.4可知測定液平均濃度C0為72.189 ng/mL，則由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合所產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

(2)

表3 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液制備引入的不確定度Table 3 Uncertainty from the preparation of series standard solutions

表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果Table 4 Results of standard curve

式中：

A1——標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，1 791.4；

A2——標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距，-175.1；

p——對C0的測定次數(shù)，p=6；

n——標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的測試次數(shù)，n=7；

綜上所述，由樣品溶液濃度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

urel(C)=

2.2.3 樣品溶液定容及稀釋引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V) 因2.2.4中測量重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度已包含樣品溶液的定容及稀釋過程，故不再另行評定。

2.2.4 測量重復(fù)性引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(x)

取同一樣品，按1.3.1方法，1.3.2和1.3.3條件對其中紐甜的含量進(jìn)行6次平行測定(n=6)，結(jié)果見表5。

表5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of repeatability test

2.3 合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

樣品稱樣量、樣品溶液的濃度、測量重復(fù)性和回收率等分量彼此之間相互獨(dú)立，將各不確定度分量合成，即得紐甜測定結(jié)果的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度:

0.045 90。

各相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量的貢獻(xiàn)值見圖1。

圖1 各相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量的貢獻(xiàn)Figure 1 Contributions of relative standard uncertainty components

2.4 擴(kuò)展不確定度

3 測量結(jié)果及其不確定度報(bào)告

用超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定炒貨中紐甜的含量，測定結(jié)果為X=(7.69±0.71) mg/kg,k=2。

4 結(jié)論

研究采用超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定炒貨中紐甜的含量，結(jié)果符合相關(guān)國標(biāo)規(guī)定的誤差要求，不確定度評定過程合理有效。通過分析可知，影響紐甜的測定結(jié)果不確定度的因素主要為樣品溶液濃度和測量重復(fù)性，其次為測量回收率和樣品稱樣量；進(jìn)一步分析可知樣品溶液濃度因素中貢獻(xiàn)較大的分量為標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。因此在實(shí)際檢測過程中要尤其關(guān)注標(biāo)準(zhǔn)溶液的相關(guān)操作過程和樣品重復(fù)性測定等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，通過增加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的稱樣量、使用準(zhǔn)確度更高的量器、增加平行樣品的測定次數(shù)、盡量提高測量回收率等措施，同時(shí)確保人員操作的規(guī)范性和一致性，以此減小測量不確定度，從而保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。