王 雪，畢宇寧，閆文帝，張 鑫，董 穎，匡子藤，林貞花，任香善

(延邊大學(xué)1. 腫瘤研究中心、2. 醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室、3. 吉林省科技廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林 延吉 133002)

膽管癌是源自膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，具有易發(fā)生轉(zhuǎn)移、預(yù)后差等特點(diǎn)[1]。目前，其治療手段以外科手術(shù)切除為主，輔以放化療[2]，但常規(guī)放化療方法具有毒副作用大、易耐藥等缺點(diǎn)。近年來，分子靶向治療是一種快速發(fā)展的治療方法，可特異性的結(jié)合腫瘤細(xì)胞并誘導(dǎo)其凋亡，但不會(huì)傷及腫瘤周圍的正常組織細(xì)胞，因此，分子靶向治療也被稱為“生物導(dǎo)彈”。

研究表明[3]，在膽管癌中，Akt/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號(hào)通路異常激活，并與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等惡性進(jìn)程呈正相關(guān)。mTOR在體內(nèi)以mTORC1和mTORC2兩種復(fù)合物的方式存在[4]。研究發(fā)現(xiàn)，mTORC1的特異性靶向藥物雷帕霉素，易出現(xiàn)負(fù)反饋?zhàn)饔?，?dǎo)致Akt的磷酸化[5]。AZD8055是一種新型的mTORC1和mTORC2雙重抑制劑(結(jié)構(gòu)見Fig 1A)，能有效抑制mTORC1復(fù)合物引起的Akt負(fù)反饋活性。在肝癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤等多種腫瘤中，AZD8055通過抑制細(xì)胞增殖和/或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到抗腫瘤作用[6-8]，但在膽管癌中的抗腫瘤作用及其分子機(jī)制尚未見報(bào)道。

原癌基因DEK是一種染色質(zhì)調(diào)節(jié)蛋白，在膽管癌中呈高表達(dá)[9]，可通過調(diào)節(jié)Akt/mTOR信號(hào)通路、轉(zhuǎn)錄因子等多種途徑，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長、浸潤等過程[10-11]，提示DEK可作為抗腫瘤的靶點(diǎn)。因此，本研究旨在探討AZD8055對膽管癌細(xì)胞HuCCT1的抑制作用，闡明其分子機(jī)制，為膽管癌的臨床治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)及理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株人膽管癌HuCCT1細(xì)胞，購自美國模式培養(yǎng)物保藏所(American Type Culture Collection，ATCC)細(xì)胞庫。

1.2 試劑AZD8055，購自美國Selleck Chemicals公司(批號(hào)：S1555)，用DMSO配制成1 mmol·L-1的濃縮液，分裝保存于-20 ℃冰箱；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、Opti-MEM培養(yǎng)基，均購自美國Gibco公司；RPMI 1640培養(yǎng)基，購自美國Corning公司；p-4EBP1、4EBP1、p-S6、S6、p-Akt、Akt、上皮型鈣黏蛋白(E-Cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、轉(zhuǎn)錄因子Snail抗體，均購自美國Cell Signaling Technology公司；DEK抗體，購自美國BD公司；β-actin抗體，購自美國Abcam公司；MTT、二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)，均購自美國Amresco；吉姆薩(Gimesa)染色液，購自日本W(wǎng)ako；DEK小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)試劑，購自廣州市銳博生物科技有限公司；Lipo 3000購自美國Invitrogen。

1.3 儀器光學(xué)倒置相差顯微鏡、奧林巴斯BX53顯微鏡(日本Olympus公司)；全波長多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)；凝膠成像儀、電泳儀(Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)HuCCT1細(xì)胞用RPMI 1640完全培養(yǎng)液(含10% FBS和1%青-鏈霉素)培養(yǎng)，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

2.2 MTT實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期的HuCCT1細(xì)胞，以5×103個(gè)(100 μL)接種于96孔板，實(shí)驗(yàn)設(shè)置對照組、AZD8055組(50、100、200、400 nmol·L-1)，每組設(shè)置6個(gè)平行孔。每組細(xì)胞培養(yǎng)24、72、120 h后，每孔加入100 μL MTT(1 g·L-1)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸棄上清，加入100 μL的DMSO充分振蕩，用全波長分光光度計(jì)，在490 nm處檢測吸光度(OD)值。AZD8055對HuCCT1細(xì)胞的生長抑制率=(1-用藥組OD值/對照組OD值)×100%。

2.3 平板集落形成實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期的HuCCT1細(xì)胞，以每孔100個(gè)的細(xì)胞密度接種于6孔板中，次日更換為完全培養(yǎng)液及分別含AZD8055(25、50、100 nmol·L-1)的培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，肉眼可見含有50個(gè)以上的細(xì)胞集落時(shí)，用PBS緩沖液清洗2次，室溫下4%多聚甲醛固定，Giemsa染液染色，自然干燥后，進(jìn)行拍照，用ImageJ軟件進(jìn)行分析。

2.4 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞生長至80%～ 90%融合后，用不含血清的培養(yǎng)液饑餓處理細(xì)胞6～8 h。用200 μL的滅菌槍頭呈“1”字形進(jìn)行劃痕，PBS清洗后，對照組和用藥組分別更換為完全培養(yǎng)液和濃度為100、200、400 nmol·L-1的AZD8055工作液，繼續(xù)培養(yǎng)，在0、12 h拍照，記錄劃痕寬度，根據(jù)公式計(jì)算劃痕愈合率：劃痕愈合率=(0 h劃痕寬度-12 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

2.5 Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期的HuCCT1細(xì)胞，用含1% FBS的培養(yǎng)液制備2×109·L-1的細(xì)胞懸液，取100 μL接種于Transwell小室中，待細(xì)胞貼壁后，上室分別加入用1% FBS配制的培養(yǎng)液及AZD8055工作液(100、200、400 nmol·L-1)，下室加入600 μL含10% FBS的完全培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，取出小室用4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，雙蒸水脫色，棉簽擦凈未遷移的細(xì)胞，將小室薄膜切下，鋪于載玻片，封片，拍照觀察并統(tǒng)計(jì)。

2.6 數(shù)據(jù)庫分析登陸STITCH在線數(shù)據(jù)庫(http://stitch.embl.de)，選擇Multpile names，輸入DEK基因及AZD8055，選擇人類種屬Homo Sapiens，確認(rèn)信息后即可顯示分析結(jié)果；登陸GeneMANIA在線數(shù)據(jù)庫(http://www.genemania.org)，選擇人類種屬Homo Sapiens，輸入DEK、Akt/mTOR信號(hào)通路的相關(guān)基因，確認(rèn)信息后即可顯示分析結(jié)果。

2.7 Western blot實(shí)驗(yàn)細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，消化接種于60 mm培養(yǎng)皿，待細(xì)胞貼壁后，分別用AZD8055工作液(0、100、200、400 nmol·L-1)處理24 h后提取總蛋白，待檢測Akt/mTOR信號(hào)通路及DEK蛋白；常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，用AZD8055(0、400 nmol·L-1)分別處理0、6、12、24 h后提取總蛋白，待檢測EMT相關(guān)蛋白。收集各組細(xì)胞，用TEPER裂解液提取總蛋白，BSA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，取40 μg蛋白行8%～10% SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，次日，洗膜，加HRP標(biāo)記二抗(1∶3 000)室溫孵育2 h，ECL法顯影、曝光，用ImageJ軟件進(jìn)行分析。

由此,通過增加電路狀態(tài)方程的階數(shù),解決了改進(jìn)型文氏橋混沌振蕩器的數(shù)學(xué)建模問題。在式(2)中引入新的無量綱變量,并對電路參數(shù)作歸一化處理,即

2.8 siRNA基因沉默實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板，分別設(shè)control組、negative control(NC)組及si-DEK組，次日待細(xì)胞生長至30%～50%，control組加入2 mL正常完全培養(yǎng)液，negative control組與si-DEK組分別加入含2 mL混合液(含1.74 mL的無雙抗有血清RPMI 1640培養(yǎng)液、250 μL Opti-MEM培養(yǎng)基、5 μL的Lipo 3000和5 μL的50 nmol·L-1的siRNA)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，待確認(rèn)沉默效果后，進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)、Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)、Western blot實(shí)驗(yàn)。本文使用的有效siRNA序列為siDEK4(5′-TGTCCTCATTAAAGAAGA A-3′)。

3 結(jié)果

3.1 AZD8055明顯抑制膽管癌細(xì)胞增殖活力與集落形成能力MTT結(jié)果顯示(Fig 1B)，與對照組相比，AZD8055(50、100、200、400 nmol·L-1)組細(xì)胞增殖活性明顯受到抑制，且呈時(shí)間-濃度依賴性(P<0.05)。平板集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示(Fig 1C)，AZD8055處理HuCCT1細(xì)胞14 d后，與對照組相比，AZD8055(25、50、100 nmol·L-1)組細(xì)胞克隆形成能力明顯減弱，且呈劑量依賴性(P<0.05)，提示AZD8055可明顯抑制HuCCT1細(xì)胞的增殖活性。

3.2 AZD8055抑制膽管癌細(xì)胞的遷移能力Fig 2A的劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AZD8055(100、200、400 nmol·L-1)作用細(xì)胞12 h后，與對照組相比，藥物處理組細(xì)胞橫向遷移距離明顯縮短。Fig 2B的Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AZD8055(100、200、400 nmol·L-1)處理HuCCT1細(xì)胞24 h后，其縱向細(xì)胞遷移能力明顯受到抑制(P<0.05)，提示AZD8055可抑制膽管癌細(xì)胞的橫向及縱向遷移能力。

3.3 AZD8055抑制Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)及EMT進(jìn)程Western blot結(jié)果顯示，AZD8055(100、200、400 nmol·L-1)作用于膽管癌細(xì)胞24 h后，Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白Akt、S6、4EBP1蛋白的磷酸化水平明顯下降(Fig 3A)。經(jīng)400 nmol·L-1的AZD8055處理6、12、24 h后，上皮標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)升高，間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin、Snail蛋白表達(dá)下降(Fig 3B)，提示AZD8055抑制Akt、S6、4EBP1的磷酸化水平及EMT進(jìn)程。

3.4 AZD8055通過調(diào)控DEK抑制膽管癌細(xì)胞的增殖及遷移能力為了檢測AZD80055抑制膽管癌細(xì)胞的增殖和遷移的機(jī)制，用STITCH數(shù)據(jù)庫分析AZD8055與DEK蛋白之間的相關(guān)性(Fig 4A)。STITCH數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，AZD8055與DEK蛋白之間具有相關(guān)性。以上提示，DEK蛋白可作為AZD8055與Akt/mTOR信號(hào)通路的樞紐蛋白，參與AZD8055抑制膽管癌細(xì)胞HuCCT1的增殖、遷移及EMT進(jìn)程的調(diào)控過程。

Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AZD8055(100、200、400 nmol·L-1)作用于膽管癌細(xì)胞24 h后，DEK蛋白表達(dá)明顯受到抑制(Fig 4B)，表明AZD8055可調(diào)控DEK蛋白的表達(dá)，與STITCH數(shù)據(jù)庫結(jié)果一致。篩選DEK基因沉默序列，結(jié)果表明，si-DEK4沉默效果最為明顯(Fig 4C)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇si-DEK4作為沉默序列?；虺聊?8 h后，膽管癌細(xì)胞的增殖能力與遷移能力明顯受到抑制(P<0.05)(Fig 4D～4F)，提示AZD8055可靶向DEK蛋白，抑制膽管癌的增殖與遷移。

Fig 1 Effect of AZD8055 treatment on proliferation and colony of HuCCT1 cells

Fig 2 Influence of AZD8055 on HuCCT1 cell migration

Fig 3 Blockade of Akt/mTOR pathway and process of EMT by AZD80055 in HuCCT cells

Western blot結(jié)果顯示，DEK基因沉默48 h后，Akt、S6、4EBP1蛋白的磷酸化表達(dá)水平明顯下調(diào)(Fig 5B)，且上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)上調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin、Snail表達(dá)下調(diào)(Fig 5C)。上述結(jié)果提示，AZD8055靶向DEK，抑制Akt/mTOR信號(hào)通路的磷酸化水平，并抑制膽管癌細(xì)胞的EMT進(jìn)程。

4 討論

膽管癌是消化道惡性程度較高的腫瘤，死亡率居高不下[1]。多項(xiàng)研究證實(shí)，AZD8055可作為一種新型抗腫瘤藥物，通過抑制增殖與誘導(dǎo)凋亡，達(dá)到良好的體內(nèi)外抗腫瘤作用[4,12]。本實(shí)驗(yàn)通過MTT法檢測AZD8055對膽管癌細(xì)胞HuCCT1增殖的影響，結(jié)果顯示，不同濃度的AZD8055能夠有效抑制膽管癌的增殖活性，呈劑量-時(shí)間依賴性；進(jìn)一步的克隆結(jié)果顯示，AZD8055可以明顯減少HuCCT1細(xì)胞的集落數(shù)量。李鵬等[7]的研究表明，AZD8055可以通過調(diào)節(jié)AMPK蛋白的磷酸化水平，抑制肝癌細(xì)胞的增殖和克隆形成能力。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AZD8055明顯抑制膽管癌細(xì)胞的橫向與縱向遷移能力。這與Giubellino等[13]的研究中，AZD8055可以通過Akt/mTOR信號(hào)通路，抑制嗜鉻細(xì)胞瘤遷移能力的結(jié)果相一致。

Akt/mTOR信號(hào)通路是腫瘤發(fā)生的一個(gè)重要信號(hào)通路，在多種腫瘤中異常激活[14]，與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、自噬與轉(zhuǎn)移等過程密切相關(guān)。Western blot結(jié)果顯示，AZD8055處理細(xì)胞后，Akt、S6和4EBP1的蛋白磷酸化水平均受到明顯抑制，提示AZD8055可通過抑制Akt/mTOR信號(hào)通路，調(diào)控HuCCT1細(xì)胞的凋亡、增殖和遷移。

DEK作為一種原癌基因參與多種生物進(jìn)程，如增殖、衰老、凋亡、分化和轉(zhuǎn)化蛋白。通過STITCH數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，AZD8055與DEK蛋白之間具有相關(guān)性。進(jìn)一步的GeneMANIA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，DEK與Akt/mTOR信號(hào)通路存在交互關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度AZD8055處理HuCCT1細(xì)胞24 h后，可明顯抑制DEK蛋白的表達(dá)水平，而沉默DEK基因明顯抑制了Akt、S6、4EBP1蛋白的磷酸化表達(dá)水平，并明顯降低膽管癌細(xì)胞增殖及遷移。Wu等[11]研究證實(shí)，下調(diào)DEK基因抑制胰腺導(dǎo)管癌的增殖和轉(zhuǎn)移，與我們的研究結(jié)果相符。本課題組前期的研究證實(shí)，DEK作為Akt的上游因子，參與和調(diào)控Akt信號(hào)通路[9]。

EMT是指上皮細(xì)胞失去細(xì)胞極性向間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生癌變時(shí)，上皮細(xì)胞間的細(xì)胞連接減弱，從而促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲能力。N?rz等[15]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AZD8055聯(lián)合MK-2206可抑制Akt/mTOR信號(hào)通路的活性，從而抑制黑色素瘤細(xì)胞的EMT進(jìn)程。本研究結(jié)果也顯示，膽管癌細(xì)胞經(jīng)AZD8055處理后，E-cadherin表達(dá)上調(diào)，Vimentin、Snail表達(dá)下調(diào)。Yang等[16]的研究證明，沉默乳腺癌細(xì)胞中的DEK基因后，E-cadherin表達(dá)上調(diào)，Vimentin、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)中的MMP-2和MMP-9表達(dá)下調(diào)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)HuCCT1細(xì)胞中DEK基因沉默后，上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)上調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin、Snail表達(dá)下調(diào)。

綜上所述，AZD8055可有效抑制HuCCT1膽管癌細(xì)胞的遷移及EMT進(jìn)程，這與降低DEK蛋白表達(dá)水平，抑制Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)。本研究將為AZD8055應(yīng)用于膽管癌的臨床治療提供新的理論依據(jù)。

Fig 4 Proliferation and migration of cholangiocarcinoma cells inhibited by AZD8055 via regulating DEK gene

Fig 5 AZD8055 targets DEK to regulate Akt/mTOR signaling pathway to inhibit EMT progress of cholangiocarcinoma cells