邵利潔,唐方

(1.濮陽(yáng)市安陽(yáng)地區(qū)醫(yī)院，河南 安陽(yáng) 455000；2.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津 300193)

過(guò)敏性鼻炎(AR)是指發(fā)生在鼻黏膜的由IgE 介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)性疾病，以鼻癢、噴嚏即鼻黏膜腫脹為主要表現(xiàn)，為臨床常見(jiàn)病和多發(fā)病[1]。根據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)，過(guò)敏性鼻炎的發(fā)病率呈逐年增加的趨勢(shì)。過(guò)敏性鼻炎屬于中醫(yī)學(xué)中“鼻鼽”范疇，其發(fā)病與肺、脾、腎氣虛密切相關(guān),因此治療重在補(bǔ)肺，解表散寒、溫肺化飲中重在固表。麻黃、細(xì)辛為該類方劑中代表藥物,為進(jìn)一步明確經(jīng)典名方抗AR藥效作用靶點(diǎn)，擬通過(guò)拆方探討單味藥物對(duì)AR大鼠藥效作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康普通級(jí)成年SD雄性大鼠45只，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2009—004。飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室。飼養(yǎng)條件：人工光照，相對(duì)濕度45%～50%，室溫24℃～26℃，專用顆粒飼料喂養(yǎng)。

1.2 藥物與試劑

麻黃、細(xì)辛飲片均購(gòu)于天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院中藥房(安徽亳州市中藥飲片廠);卵白蛋白(OVA，Sigma公司)；百日咳桿菌(北京天壇生物制品有限公司)；氫氧化鋁[Al(OH)3，天津大學(xué)科威公司]；甲醛(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；LTC4試劑盒、IL-4試劑盒和IFN-γ試劑盒(上海BLUE GENE生物科技有限公司)。

1.3 儀器

NanoQuant酶標(biāo)儀(奧地利)；TL218M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(上海市離心機(jī)械研究所)；恒溫箱(上海和呈儀器制造有限公司)；Eppendorf Reference微量移液器。

2 方法

2.1 分組

45只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3天，采用體質(zhì)量隨機(jī)分組法將其分為空白對(duì)照組(N)、模型組(C)、麻黃等效劑量組(M10)、細(xì)辛高劑量組(X15)和細(xì)辛等效劑量組(X10)等5組，每組9只。

2.2 模型制備

依照文獻(xiàn)模型制備方法[2-6]，第1天，分別在大鼠左右兩后肢足跖部的皮下、雙側(cè)腹股溝皮下及腹腔注射0.2 mL的抗原佐劑混懸液(每毫升含OVA 1 mg,百日咳桿菌5×109個(gè)及氫氧化鋁200 mg)進(jìn)行初次致敏。根據(jù)初次致敏方法，7天后進(jìn)行強(qiáng)化致敏，藥物用量同前。局部抗原攻擊：初次致敏第15天用移液器進(jìn)行卵白蛋白生理鹽水溶液(10 g/L)滴鼻,每側(cè)鼻孔15μL，每日1次，連續(xù)滴鼻7天?？瞻捉M單獨(dú)飼養(yǎng)，自由飲食水，同期與模型鼠相同部位分別注射0.2 mL的生理鹽水，7天后強(qiáng)化方法及用量同前。第15天生理鹽水滴鼻，用量和時(shí)間相同。

2.3 給藥方法

于第22天(模型制備結(jié)束后第2天)各組大鼠分別灌胃給藥。麻黃組1.5 g/(kg·d)，相當(dāng)于人體等效劑量；細(xì)辛1.5 g/(kg·d)、1.0 g/(kg·d)，相當(dāng)于人體劑量15倍和等效劑量。每日 1 次，2 mL/只；空白對(duì)照組和模型組大鼠分別灌服同量生理鹽水。連續(xù)14天。

2.4 標(biāo)本采集

給藥結(jié)束24 h后，大鼠股動(dòng)脈放血致死，取血6 mL，靜置2 h后，4 000 r/pm離心，10 min，血清于-20 ℃冷凍保存。采用ELISA法測(cè)定血清IFN-γ、IL-4和LTC4水平，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.5 組織病理標(biāo)本采集

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠股動(dòng)脈放血致死，斷頭，迅速沿鼻中線剪開(kāi)鼻腔，暴露鼻中隔及雙側(cè)鼻腔，游離鼻中隔(包括鼻中隔軟骨及其兩側(cè)私膜)，10%甲醛固定，常規(guī)脫水，包埋，切片，HE染色。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 組織病理學(xué)觀察

光鏡下，空白組鼻黏膜上皮未見(jiàn)損傷，假?gòu)?fù)層柱狀纖毛上皮未見(jiàn)變性壞死、增生及萎縮，形態(tài)及結(jié)構(gòu)完整，黏膜下層有少數(shù)充血，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及黏液、漿液腺腺體增生。模型組鼻黏膜假?gòu)?fù)層柱狀纖毛上皮明顯增厚，杯狀細(xì)胞增多，黏膜下腺體增生，間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、毛細(xì)血管明顯擴(kuò)張充血，黏膜上皮明顯破損。三個(gè)用藥組較模型組大鼠鼻黏膜上皮損傷程度明顯減輕，毛細(xì)血管擴(kuò)張充血及嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯改善，鼻黏膜破損明顯減輕，黏膜下層黏液及漿液腺體減少，僅見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，輕度充血水腫。結(jié)果見(jiàn)圖1。

3.2 各組大鼠血清IFN-γ、IL-4、LTC4含量比較

與空白對(duì)照組相比，模型大鼠血清 IFN-γ含量降低，IL-4、LTC4含量升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組相比，M10組血清IFN-γ含量升高、LTC4呈不同程度降低，但未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,血清IL-4降低(P<0.01)；X15、X10組血清IFN-γ升高(P<0.05)、IL-4、LTC4水平降低，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05,P<0.01)。三個(gè)用藥組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見(jiàn)表1。

注：a.空白組；b.模型組；c.M10組；d.X15組；e.X10組。圖1 各組鼻黏膜病理組織切片(HE，40×10)

表1 各組大鼠血清IFN-γ、IL-4及LTC4含量比較

注：與空白組相比，△△P<0.01，△P<0.05；與模型組相比，**P<0.01，*P<0.05。

4 討論

過(guò)敏性鼻炎屬于中醫(yī)學(xué)“鼻鼽”范疇。有學(xué)者認(rèn)為， AR患者以臟腑功能失調(diào)，六淫、飲食等誘因侵襲的本虛標(biāo)實(shí)為病機(jī)特征。素體陽(yáng)氣不足，機(jī)體防御能力下降，外邪易襲太陽(yáng)、少陽(yáng)經(jīng)，病位在肺，治以解表散寒、溫肺化飲、宣通鼻竅。常選用小青龍湯、麻黃附子細(xì)辛湯作為治療過(guò)敏性鼻炎的基本方劑,臨床療效顯著。課題組前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)[5-6]，小青龍湯多靶點(diǎn)抗鼻過(guò)敏反應(yīng)作用，可能是通過(guò)提高TH1類細(xì)胞因子IL-12含量，降低IgE水平,從而實(shí)現(xiàn)降低炎性介質(zhì)分泌，改善鼻黏膜水腫，緩解鼻炎癥狀。而小青龍湯、麻黃附子細(xì)辛湯皆以麻黃、細(xì)辛為主要藥物。為進(jìn)一步闡釋“溫肺化飲”“溫經(jīng)散寒”功效作用機(jī)制與科學(xué)內(nèi)涵，本實(shí)驗(yàn)擬以麻黃、細(xì)辛為代表，通過(guò)拆方進(jìn)行明確經(jīng)典名方抗AR藥效作用靶點(diǎn)。

AR的發(fā)病機(jī)制主要是當(dāng)過(guò)敏原進(jìn)入特應(yīng)性個(gè)體后，機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生相應(yīng)的IgE抗體，并附著于肥大細(xì)胞、嗜堿粒細(xì)胞的表面，機(jī)體即處于致敏狀態(tài)[7]。在變態(tài)反應(yīng)性炎癥中起主要作用的是CD4+T輔助細(xì)胞，其通過(guò)釋放一系列的細(xì)胞因子，對(duì)變態(tài)反應(yīng)性炎癥起到調(diào)節(jié)作用，Th1細(xì)胞分泌IL-2、IFN-γ等細(xì)胞因子，Th2細(xì)胞分泌IL-4等細(xì)胞因子[8-9]。AR發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中炎癥與免疫調(diào)控失衡是其病機(jī)的主要方面，本研究顯示，麻黃與細(xì)辛能在一定程度上修復(fù)受損鼻黏膜組織，減少鼻黏膜上皮的脫落，減輕毛細(xì)血管充血及嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。其藥效通過(guò)抑制血清炎性遞質(zhì)LTC4的產(chǎn)生及調(diào)節(jié)THI/TH2免疫平衡來(lái)實(shí)現(xiàn)，具有降低IL-4，升高IFN-γ水平的作用。

考慮到大劑量麻黃會(huì)對(duì)心率產(chǎn)生影響，本實(shí)驗(yàn)只選取麻黃等效劑量，結(jié)果顯示，麻黃用藥組雖然能夠明顯減輕AR大鼠鼻黏膜上皮組織損傷，改善毛細(xì)血管充血及嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。但對(duì)IFN-γ、LTC4未顯示與細(xì)辛相同的調(diào)節(jié)效應(yīng)。是否與劑量及藥物配伍協(xié)同作用有關(guān)尚有待進(jìn)一步驗(yàn)證。