李大宇，滕萍英

(桂林醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林 541000)

大腸癌(Colorectal cancer)是常見的惡性腫瘤，發(fā)病年齡趨老年化，男女比為1.65∶1。 在西方發(fā)達(dá)國(guó)家，其發(fā)病率位在各類型腫瘤中居第二位[1]。在中國(guó)，大腸癌在所有腫瘤發(fā)病率中排名第5位，而且上升趨勢(shì)明顯。全球每年大約102萬(wàn)新發(fā)病例，53萬(wàn)死亡病例[2]，其中我國(guó)每年新發(fā)病人數(shù)約40萬(wàn)人，死亡為7.35/10。針對(duì)大腸癌的化療藥物主要包括卡培他濱、氟尿嘧啶(5-FU)、伊立替康、亞葉酸(leucovorin)、奧沙利鉑和UFT[3]，有時(shí)也使用表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑[4]。5-氟尿嘧啶(5-FU)一直是全身細(xì)胞毒性化療的基石[5],廣泛應(yīng)用于臨床，但是約1/3接受5-FU治療的患者會(huì)出現(xiàn)客觀的反應(yīng)和黏膜炎、腹瀉、骨髓抑制等毒性作用[6],并且出現(xiàn)了耐藥特性[7]。因此，當(dāng)前需要開發(fā)新的藥物或者聯(lián)合用藥以治療大腸癌患者。在天然產(chǎn)物中尋找高效、低毒并且能提高患者順應(yīng)性的治療藥物是新藥研發(fā)的著眼點(diǎn)。白芷為傘形科植物白芷[Angelicadahurica(Fisch．ex Hofhn．) Ben th．et Hook．F．]或杭白芷[A.dahurica(Fisch．ex Hoffm．)Benth．et Hook．F．var． Formosana (Boiss．)Shan et Yuan]的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品, 性辛溫，入肺、胃經(jīng)，具有散風(fēng)除濕、通竅止痛、消腫排膿、生肌的作用。用于感冒頭痛、鼻塞、鼻淵、牙痛、白帶、瘡瘍腫痛、白癜風(fēng)以及牛皮癬等。目前從白芷中分離鑒定出香豆素及其衍生物55種[8]、揮發(fā)油類111種[9]、苷類成分9種[10-13]以及其他成分如白芷毒素(angelicotoxin)[14]、微量元素等?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，白芷具有抗炎鎮(zhèn)痛、抑制病原微生物、清除自由基、抗腫瘤、保肝以及美白等多種藥理活性。其中香豆素類成分——戊烯氧呋喃豆素和異歐前胡素[15]、異歐芹屬素乙、蛇床素、氧化前胡內(nèi)酯、白當(dāng)歸腦、水合羥基前胡素[16]等對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞株和肺癌A549細(xì)胞株、卵巢癌SK-OV-3細(xì)胞株和結(jié)腸癌HCT-15C細(xì)胞株等有明顯的細(xì)胞毒作用?？梢姲总频目鼓[瘤藥理特性具備充分的研究基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)使用白芷提取物通過大腸癌CT-26細(xì)胞株荷瘤裸鼠模型，測(cè)定白芷提取物(AD-2P)與5-FU、leucovorin(LV)聯(lián)合用藥的治療效果，觀察其在荷瘤小鼠體內(nèi)的抗腫瘤情況，檢測(cè)AD-2P對(duì)巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑

酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(authos 2010 17750, Austria)；血清分析儀(Roche cobas c111)；血液分析儀(HORIBA&，LC 660)；CO2培養(yǎng)箱(SANYO,Japan)；低溫高速離心機(jī)(TOYM, Japan)；Tecan Infinite F200 micro-plate reader(Tecan, Mannedorf，Switzerland)；10%胎牛血清(FBS; Gibco, Franklin Lakes, NJ, U.S.A.)；Trypsin-EDTA (Gibco, Franklin Lakes, NJ, U.S.A.)；青霉素-鏈霉素(Sigma St.Louis, MO, USA)；脂多糖(LPS，Sigma St. Louis, MO,USA)；5-氟尿嘧啶(5-FU)、亞葉酸(LV)(上海斯信生物科技)；白芷提取組分(AD-2P)為白芷水煎濃縮物使用大孔樹脂柱在20%甲醇洗脫梯度下得到的流分，經(jīng)濃縮，再使用冷75%乙醇溶液溶解后取得的沉降物； 裸鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；一氧化氮(NO)檢測(cè)試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)；兔抗ERK1/2、兔抗JNK、P38 MAPK抗體(小鼠單抗)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與腫瘤株

小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7和大腸癌細(xì)胞株CT26購(gòu)自ATCC(American Type Culture Collection, Rockville,MD)；SPF級(jí)BALB/c裸鼠,6周齡,體質(zhì)量(20±2)g,購(gòu)自美國(guó)ORIENT公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 CT26細(xì)胞株荷瘤裸鼠模型構(gòu)建

BALB/c裸鼠,6周齡,體質(zhì)量(20±2)g，雌雄各半，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心恒溫25℃～27℃、恒濕45%～50%、新鮮空氣、除塵除菌的無特殊病原菌(SPF級(jí))飼養(yǎng)室條件下，飼養(yǎng)純化1周后，取相近體質(zhì)量約22 g小鼠分為正常組(無細(xì)胞移植組)、生理鹽水組(control組)、5FU組、5FU+LV組、白芷提取物組、5FU+白芷提取物組和5FU+LV+白芷提取物組，每組10只。CT26細(xì)胞(2×105/100 μL DMEM培養(yǎng)液)皮下注射于BALB/c裸鼠的左前肢，腫瘤培育生長(zhǎng)14天，體積達(dá)到約32 mm3[腫瘤體積mm3=(W1× W1×W2)×π/6，其中W1和W2分別為最大和最小的腫瘤直徑(mm)]時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2 給藥方法

細(xì)胞移植建模后第15天，將(AD-2P)與5-FU，LV組合，通過灌胃及腹腔注射途徑，觀測(cè)各組的體質(zhì)量變化和腫瘤生長(zhǎng)情況。生理鹽水組(Control組)按0.02 ml/(g·d)灌胃、5FU組單次腹腔注射90 mg/kg、5FU+LV組單次腹腔注射劑量分別為90 mg/kg+100 mg/kg、(AD-2P)組按500 mg/(kg·d)灌胃、5FU+(AD-2P)組單次腹腔注射90 mg/kg+500 mg/(kg·d)灌胃、5FU+LV+(AD-2P)組單次腹腔注射90 mg/kg+100 mg/kg+500 mg/(kg·d)灌胃和單次腹腔注射90 mg/kg+100 mg/kg+100 mg/(kg·d)灌胃兩組。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 小鼠體征、腫瘤及血液情況測(cè)定

給藥14天期間，每日相同時(shí)間段內(nèi)測(cè)量各組小鼠的體質(zhì)量和腫瘤大小，觀察小鼠體質(zhì)變化。第15天，乙醚麻醉，從腹帶動(dòng)脈取血，檢驗(yàn)血液指標(biāo)(紅細(xì)胞、血紅蛋白、白細(xì)胞計(jì)數(shù)和血小板計(jì)數(shù)等)；取部分全血凝固30 min后，圓心分離(3 000 rpm，15min)獲得血清，檢測(cè)ALT、AST數(shù)值；取小鼠肝臟、脾臟和胸腺，稱重。

1.3.2 ELASA法檢測(cè)AD-2P對(duì)巨噬細(xì)胞株的細(xì)胞因子分泌影響

RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle medium), 添加10%胎牛血清(FBS)、青霉素(100 μg/mL)和鏈霉素(100 μg/mL)。RAW264.7細(xì)胞(5×105cell/mL)在平底96孔微量滴定板中培養(yǎng)12 h，一式四份。此后，用AD-2P(10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、500 μg/mL)、LPS(0.1 μg/mL)、多粘菌素(PMB，10 μg/mL)等組合處理的新鮮培養(yǎng)基替換100 μL培養(yǎng)基，并繼續(xù)培養(yǎng)24 h。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)收集培養(yǎng)上清液，測(cè)定產(chǎn)生一氧化氮(NO)、TNF-α的表達(dá)水平；具體步驟參照ELISA試劑盒說明書操作。

1.3.3 Western blot法檢測(cè)AD-2P在MAPK通路的蛋白表達(dá)

RAW 264.7細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)，加入LPS(0.1 μg/mL)孵育30 min、AD-2P(0.001 μg/mL、0.01 μg/mL、0.1 μg/mL、1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL)孵育30 min后，收集細(xì)胞溶解液，提取總蛋白。RAW 264.7細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)，加入LPS(0.1 μg/mL)孵育30 min、AD-2P(5 μg/mL)分別孵育15 min、30 min、45 min和60 min后，收集細(xì)胞溶解液，提取總蛋白。用蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定MAPK磷酸化的表達(dá)水平。兔抗ERK1/2、兔抗JNK、P38 MAPK抗體(小鼠單抗)參照試劑說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)各配伍組合的組間比較，采用T-檢驗(yàn)以及方差分析法。P≤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CT26荷瘤裸鼠一般狀況觀察

CT26細(xì)胞(2×105/100 μL DMEM培養(yǎng)液)皮下注射于BALB/c裸鼠的左前肢接種后，所有裸鼠均建模成功。每天給藥后觀察，小鼠精神狀態(tài)良好，活動(dòng)與進(jìn)食正常。伴隨時(shí)間變化，左腋下瘤體逐漸增大，大部分小鼠出現(xiàn)一定程度的活動(dòng)不便，但不影響進(jìn)食。至給藥14天結(jié)束，所有小鼠均存活。

2.2 各給藥組對(duì)CT26荷瘤裸鼠的抗腫瘤效果

分別使用濃度為500 mg/kg的AD-2P灌胃、5-Fu(90 mg/mL)腹腔注射和LV(100 mg/mL)腹腔注射等聯(lián)合治療小鼠大腸癌CT26細(xì)胞接種移植的BALB/C小鼠，觀察AD-2P在裸鼠體內(nèi)治療效果。藥物處理第15天，各組小鼠稱重、測(cè)瘤體積后，麻醉取血、手術(shù)摘除組織器官、剝離瘤體稱重。AD-2P、5-Fu和LV等聯(lián)合給藥組合，對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響如圖1所示。 AD-2P協(xié)同5-Fu和LV治療組抑制小鼠腫瘤的生長(zhǎng)，有顯著差異(P<0.05)。5-FU和LV組治療組抑制小鼠腫瘤的生長(zhǎng)效果最強(qiáng)，有顯著差異(P<0.01)(圖1A)；取組織器官肝、脾、胸腺和瘤體稱重后發(fā)現(xiàn)，5-Fu和LV治療組的瘤體平均重量為1.39 g，AD-2P協(xié)同5-Fu和LV治療組的小鼠瘤體平均重量為1.58 g。兩組小鼠的瘤重顯著低于其他組別，在瘤體重量相近的狀況下，AD-2P協(xié)同治療組小鼠的體質(zhì)量明顯高于5-Fu、LV組(圖1B)，同時(shí)胸腺增重明顯，其他無明顯差異。

2.3 AD-2P對(duì)LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞的一氧化氮(NO)與TNF-α產(chǎn)物的分泌影響

巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞用不同濃度的AD-2P(10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、500 μg/mL)、LPS(0.1 μg/mL)、多粘菌素(PMB，10 μg/mL)等組合處理24 h后，收集培養(yǎng)上清液，用ELISA方法檢測(cè)NO和TNF-α分泌情況。結(jié)果如圖2所示， AD-2P(10 μg/mL)以及濃度更高時(shí)，可促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞的NO分泌量， 與media空白組相比有顯著差異(P<0.05)，呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系；AD-2P(10 μg/mL)以及濃度更高時(shí)，可促進(jìn)TNF-α分泌量，與media空白組相比有顯著差異(P<0.05)，呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。

圖1 給藥組對(duì)CT26荷瘤裸鼠腫瘤的影響和體質(zhì)量變化

圖2 AD-2P對(duì)RAW264.7細(xì)胞的一氧化氮(NO)、TNF-α分泌影響

2.4 AD-2P對(duì)RAW264.7細(xì)胞在MAPK通路的蛋白表達(dá)影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示(圖3)，AD-2P在不同劑量梯度下，對(duì)RAW264.7細(xì)胞的MAPK通路ERK1/2、JNK與P38的磷酸化活化產(chǎn)物P-ERK1/2、P-JNK和P-P38的蛋白表達(dá)量增加，且呈劑量依賴關(guān)系，ERK、JNK與P38蛋白比較無顯著差異(P>0.05)(圖3A)；使用AD-2P(5 μg/mL)分別孵育不同時(shí)間，獲取蛋白檢測(cè)結(jié)果顯示， P-ERK在孵育30 min、45 min和60 min的蛋白表達(dá)量顯著增加(P<0.05)，P-JNK、P-P38的蛋白表達(dá)有增加，但無顯著性差異(P>0.05)； ERK1/2、JNK及P38等蛋白表達(dá)無顯著性差異(圖3B)。

圖3 AD-2P對(duì)RAW 264.7細(xì)胞MAPK通路下的蛋白表達(dá)

3 討論

癌癥是威脅人類健康問題的主要?dú)⑹?，其發(fā)生率和死亡率呈逐年上升的趨勢(shì)?；熀头暖煹确椒ㄔ趶V泛應(yīng)用的同時(shí)，出現(xiàn)了耐藥性和毒副作用，極大降低了患者的生存質(zhì)量。我國(guó)擁有豐富的中草藥資源，在中草藥中尋找有效、低毒的抗腫瘤藥物，來改善腫瘤患者的長(zhǎng)期生活質(zhì)量，是藥物研究的重要方向。白芷是我國(guó)常用的傳統(tǒng)中藥材，功效主要是散風(fēng)除濕、通竅止痛、消腫排膿?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，白芷具有抗菌抗炎、解熱平喘、降低血壓和抗腫瘤等作用。本實(shí)驗(yàn)在研究初期發(fā)現(xiàn)白芷水煎劑在抗大腸癌小鼠模型中展現(xiàn)了良好的抗腫瘤效果，繼而分離出AD-2P組分進(jìn)行了進(jìn)一步的抗腫瘤實(shí)驗(yàn)，并研究了該組分體外在RAW 264.7細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。

在CT26細(xì)胞株荷瘤裸鼠模型中，AD-2P協(xié)同5-FU和LV治療組，在灌胃14天后，與對(duì)照組(Control)相比，表現(xiàn)了一定的抗腫瘤作用。雖然對(duì)比5-FU和LV治療組，抑瘤效果不足，但在小鼠體質(zhì)量恢復(fù)上表現(xiàn)良好，小鼠生存狀態(tài)優(yōu)良。檢測(cè)組織器官肝臟、脾臟無明顯變化，中樞免疫器官胸腺略有增大，此現(xiàn)象將AD-2P的抗腫瘤機(jī)制導(dǎo)向其免疫調(diào)節(jié)作用。

NO是一種重要的生物活性物質(zhì)，除了在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中作為重要的信息傳遞物質(zhì)外，還廣泛參與包括免疫反應(yīng)在內(nèi)的機(jī)體多系統(tǒng)的生理和病理過程[17-19]。當(dāng)巨噬細(xì)胞收到刺激活化后，釋放大量的NO，具有細(xì)胞毒作用，可殺傷微生物(細(xì)菌、真菌、病毒)、寄生蟲和腫瘤細(xì)胞等[20]。在體外實(shí)驗(yàn)中，AD-2P可顯著增加RAW264.7細(xì)胞的NO產(chǎn)物的分泌。提示AD-2P是巨噬細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)。細(xì)胞因子TNF-α與NF-κB的信號(hào)通路有關(guān)，具有良好的抗腫瘤作用和多種免疫調(diào)節(jié)功能。AD-2P(10 μg/mL～500 μg/mL)隨著濃度劑量的加大， TNF-α的生成，與media空白組相比產(chǎn)生顯著差異(P<0.05)，且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。提示AD-2P可能通過激活NF-κB的信號(hào)通路，導(dǎo)致增加TNF-α分泌量，增加細(xì)胞免疫功能。

MAPK是介導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化的和炎癥基因表達(dá)的TLR4(Toll-like receptor 4)信號(hào)途徑的重要下游信號(hào)分子。Western blot實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)不同濃度的AD-2P作用后，對(duì)RAW264.7細(xì)胞的MAPK通路ERK1/2、JNK與P38的磷酸化活化產(chǎn)物P-ERK1/2、P-JNK和P-P38的蛋白表達(dá)量增加(P<0.05)，并呈梯度依賴。時(shí)間依賴試驗(yàn)中，P-ERK蛋白表達(dá)量顯著增加(P<0.05)，P-JNK和P-P38的蛋白表達(dá)也有一定增加。提示AD-2P對(duì)MAPK的3個(gè)亞群ERK1/2、JNK、P38均發(fā)生磷酸化而活化，可能具有激活MAPK通路的作用。

綜上所述，AD-2P可能通過增加NO和TNF-α產(chǎn)物，激活MAPK通路的ERK1/2、JNK和P38蛋白表達(dá)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，從而抑制大腸癌瘤體的增長(zhǎng)，為進(jìn)一步研究開發(fā)新的抗腫瘤藥物提供了可能。