薛仁風(fēng)，豐 明，趙 陽，陳 劍，李 韜，葛維德

(遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物研究所，遼寧 沈陽 110161)

生長素調(diào)節(jié)蛋白(Auxin-regulating protein，ARP)是一類參與植物生長發(fā)育調(diào)控的重要蛋白質(zhì)因子。天然植物生長素的主要活性形式是吲哚-3-乙酸(Indole-3-acetic acid，IAA)，生長素在調(diào)控植物的生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用，在植物的抗病反應(yīng)調(diào)控中也同樣具有重要功能，許多植物病原菌通過自身產(chǎn)生生長素或者操縱植物合成生長素，從而干涉植物的正常發(fā)育過程[1-4]。擬南芥生長素不敏感突變體dth9對幾種病菌的侵染表現(xiàn)更加敏感[5]，而其生長素敏感突變體卻增強(qiáng)了植株對病原物的抗性[6-7]。植物大多數(shù)生長素調(diào)節(jié)蛋白均具有IAA酰胺合成酶的活性，通過結(jié)合IAA并使其氨?；?，維持植物體內(nèi)的生長素動態(tài)平衡[8]。DING等[9]證明水稻受白葉枯病原菌誘導(dǎo)產(chǎn)生生長素，生長素積累刺激了松弛細(xì)胞壁的蛋白質(zhì)——伸展蛋白的產(chǎn)生，從而誘導(dǎo)植物細(xì)胞壁的松弛蛋白質(zhì)的表達(dá)，弱化植物細(xì)胞壁作為天然屏障的防御作用，而植物則可以通過激活一類IAA酰胺合成酶GH3-8使生長素的主要形式IAA失活，抑制生長素信號和細(xì)胞壁松弛蛋白質(zhì)表達(dá)，從而增強(qiáng)細(xì)胞壁抵抗病原菌侵染的能力。另外，GH3-8受不同病原物誘導(dǎo)，包括白葉枯病菌和稻瘟病菌[10]，說明GH3-8參與的寄主抗性不具有小種專一性，其參與調(diào)節(jié)基礎(chǔ)抗性。鐮孢菌菜豆專化型(Fusariumoxysporumf.sp.phaseoli)引起的鐮孢菌枯萎病是普通菜豆生產(chǎn)中的重要土傳真菌性病害，嚴(yán)重影響菜豆產(chǎn)量，然而關(guān)于普通菜豆(PhaseolusvulgarisL.)抗鐮孢菌枯萎病相關(guān)生長素調(diào)節(jié)蛋白基因的克隆及其表達(dá)特性的研究尚未見報(bào)道。鑒于此，從鐮孢菌枯萎病原菌誘導(dǎo)的普通菜豆根組織中分離出1個(gè)編碼生長素調(diào)節(jié)蛋白的基因，命名為PvARP1(GenBank登錄號：MK301448)，利用生物信息學(xué)方法對其序列進(jìn)行初步分析，同時(shí)，對該基因在病原菌誘導(dǎo)下的表達(dá)特點(diǎn)和體外生物學(xué)活性進(jìn)行分析，以期進(jìn)一步探討該基因在菜豆抗枯萎病過程中的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

供試普通菜豆感病品種BRB130和抗病品種260205由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院國家作物種質(zhì)資源庫提供，普通菜豆鐮孢菌枯萎病原菌FOP-DM01菌株(Fusariumoxysporumf.sp.phaseoliisolate FOP-DM01)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所保存。7～10 d的普通菜豆幼苗用于病原菌的接種，參照XUE等[11]的方法進(jìn)行。接種病原菌0、24、48、72、96、120 h后于根部取樣，以未接種病原菌普通菜豆根組織作為對照。利用100 μmol/L水楊酸(SA)、100 μmol/L IAA、0.01%乙烯(ET)、100 μmol/L茉莉酸(JA)分別浸泡菜豆BRB130和260205幼苗根2～3 min，處理后移栽于滅菌營養(yǎng)土中，分別于0、24、48、72、96、120 h從根部取樣，以分別浸泡0.001% 乙醇溶液和0.015% Silwet L-77的菜豆根為對照[12-13]。在菜豆不同器官中取樣，通過qRT-PCR檢測PvARP1基因在根、莖、葉、花、莢中的表達(dá)量。將所取樣品迅速置于液氮中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA的提取與cDNA合成

采用Trizol試劑提取各組織樣品的總RNA，具體方法參照試劑說明書。以提取總RNA中mRNA為模板，利用Reverse transcriptase system 試劑盒(Promega，USA)合成第1鏈cDNA，用于基因克隆和表達(dá)量分析。

1.3 PvARP1基因全長cDNA克隆

根據(jù)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物抗病鑒定及評價(jià)課題組構(gòu)建的cDNA-AFLP差異顯示文庫中已有的一條EST序列CBFi28[14]， 采用Phytozome 12.0數(shù)據(jù)庫中BLAST功能進(jìn)行序列比對，將包含CBFi28片段序列的基因確定為普通菜豆生長素應(yīng)答GH3基因家族基因(Phvul.003G238700.1)，根據(jù)該GH3基因序列設(shè)計(jì)引物，AF-1為5′-GCAGCCATCACTTTCTGATACCAACA-3′，AF-2為5′-AACCACCACCCATTCCTTTCACTCT-3′，以從菜豆260205根所提取RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行cDNA全長的擴(kuò)增。PCR程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。將PCR產(chǎn)物送北京英濰捷基生物公司測序。

1.4 PvARP1序列分析

利用生物信息學(xué)軟件在線分析PvARP1基因編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列、理化參數(shù)、一級結(jié)構(gòu)、跨膜結(jié)構(gòu)域、信號肽序列、疏水結(jié)構(gòu)域、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)。利用ClustalX和MEGA軟件分別進(jìn)行氨基酸序列同源性比對和進(jìn)化樹分析。

1.5 PvARP1基因表達(dá)量分析

通過qTOWER 2.2實(shí)時(shí)定量PCR儀(Analytikjena，Germany)，采用SuperReal PreMix (SYBR green，Tiangen，China)熒光定量PCR分析PvARP1基因表達(dá)量。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法分析，確定基因的相對表達(dá)量，每個(gè)取樣點(diǎn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。熒光定量PCR引物(F：5′-AATCGGAGACGAAGACGC-3′; R：5′-GGAAGGAATCAGGGCAGA-3′)根據(jù)PvARP1的cDNA序列設(shè)計(jì)，以普通菜豆的ACTIN基因作為內(nèi)參，設(shè)計(jì)引物(F：5′-GAAGTTCTCTTCCAACCATCC-3′; R：5′-TTTCCTTGCTCATTCTGTCCG-3′)[15-16]。

1.6 PvARP1基因原核表達(dá)及蛋白質(zhì)純化

通過引物(5′-GCCATATGATGGCCATTGCTGCTGAC-3′/5′-GCCTCGAGACGACGACGTTCGGG-GGA-3′)在PvARP1基因上游和下游分別引入NedⅠ和XhoⅠ內(nèi)切酶位點(diǎn)，經(jīng)NedⅠ和XhoⅠ雙酶切將基因連接入經(jīng)相同酶切的pET42a(+)載體，構(gòu)建PvARP1基因的原核表達(dá)載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)，挑取陽性克隆測序，命名為pET-PvARP1。將鑒定正確的陽性克隆單菌落接種于含50 μg/mL Kan的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。將上述菌液按1∶100接種于新鮮LB液體培養(yǎng)基(含50 μg/mL Kan)，37 ℃條件下200 r/min振蕩培養(yǎng)2～3 h，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)。表達(dá)蛋白用6×His融合蛋白純化試劑盒(Pierce，Rockford，IL) 純化，操作步驟：收集誘導(dǎo)表達(dá)菌體，通過超聲波破碎菌體細(xì)胞壁，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，取上清液，用親和層析柱吸附重組表達(dá)蛋白，緩沖液清洗2～3次，去除非特異性吸附蛋白質(zhì)，用含有500 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液收集重組表達(dá)蛋白。

1.7 PvARP1重組蛋白活性分析

蛋白質(zhì)活性測定反應(yīng)程序參照STASWICK等[8]的方法，具體操作：在20 μL反應(yīng)體系中加入50 mmol/L Tris (pH值7.5)、3 mmol/L MgCl2、3 mmol/L ATP、1 mmol/L DTT、1 mmol/L IAA、1 mmol/L 氨基酸、5 μL的PvARP1純化蛋白質(zhì)，25 ℃分別反應(yīng)0、5、10、20、30 min，反應(yīng)結(jié)束后在體系中加入100 μL的甲醇溶液，取5 μL樣品定量分析反應(yīng)產(chǎn)物。采用高效液相色譜儀(Agilent 1100,Agilent technologies，Palo alto，CA)進(jìn)行檢測，使用Agilent C18 Zorbax ODS column (250 mm×5 mm) 色譜柱，程序運(yùn)行溫度為25 ℃，流動相(0.1% H3PO4)維持5 min，然后在4 min內(nèi)以線性梯度逐漸轉(zhuǎn)換為40%甲醇溶液，持續(xù)8 min，流速為1 mL/min，檢測波長為230 nm。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0和Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 普通菜豆生長素調(diào)節(jié)蛋白基因PvARP1全長cDNA序列克隆和分析

包含普通菜豆生長素調(diào)節(jié)蛋白基因PvARP1的片段全長為2 428 bp，經(jīng)ORF finder預(yù)測，具有完整開放閱讀框。通過PCR擴(kuò)增得到預(yù)期長度的產(chǎn)物，將其命名為PvARP1。將完整的PvARP1基因開放閱讀框序列連接至克隆載體pMD18-T，測定DNA序列。結(jié)果顯示，原序列508―2 325位核苷酸為開放閱讀框，長1 818 bp，編碼605個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，PvARP1蛋白含有14個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)、17個(gè)β-折疊結(jié)構(gòu)，其余為Loop結(jié)構(gòu)(圖1)。

下劃線部分為α-螺旋結(jié)構(gòu)，灰色部分為β-折疊結(jié)構(gòu)

2.2 普通菜豆生長素調(diào)節(jié)蛋白基因PvARP1編碼蛋白質(zhì)序列分析

PvARP1所編碼蛋白質(zhì)的預(yù)測分子質(zhì)量為68.26 ku，理論pI值為5.81。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，該蛋白質(zhì)不含跨膜區(qū)，無明顯的疏水結(jié)構(gòu)域，無信號肽序列，不屬于分泌蛋白。PvARP1的氨基酸序列與小豆(XP_017412459.1)、木豆(XP_020231129.1)、黎豆(RDY08267.1)等多種作物的ARP基因所編碼的氨基酸序列具有很高的同源性。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析(圖2)結(jié)果表明，PvARP1與小豆的ARP蛋白(VaARP)親緣關(guān)系最近，達(dá)到94%。

圖2 普通菜豆生長素調(diào)節(jié)蛋白PvARP1與8個(gè)其他來源的ARP蛋白的進(jìn)化關(guān)系Fig.2 Evolutionary relationship of auxin-regulating protein PvARP1 in common bean and 8 ARP proteins from other species

2.3 普通菜豆生長素調(diào)節(jié)蛋白基因PvARP1的表達(dá)分析

2.3.1 枯萎病原菌誘導(dǎo)普通菜豆生長素調(diào)節(jié)蛋白基因PvARP1表達(dá)分析 接種病原菌后，抗病材料260205和感病材料BRB130根中PvARP1表達(dá)量與各自接種0 h相比，均顯著升高(P<0.05)。同一接種時(shí)間260205表達(dá)量均顯著高于BRB130，接種24 h 260205根中PvARP1表達(dá)量上調(diào)最高，達(dá)到其接種0 h基因表達(dá)量的111倍；接種48～120 h，260205根中PvARP1表達(dá)量仍然維持在較高水平，可達(dá)其接種0 h基因表達(dá)量的42～56倍(圖3)。上述結(jié)果表明，PvARP1基因受FOP-DM01菌株誘導(dǎo)表達(dá)量顯著上調(diào)，即抗病材料表達(dá)量顯著高于感病材料。

2.3.2 外源激素誘導(dǎo)普通菜豆生長素調(diào)節(jié)蛋白基因PvARP1表達(dá)分析 SA、JA和ET處理不同時(shí)間BRB130和260205中PvARP1基因表達(dá)量變化并不明顯，甚至略有降低。IAA處理后BRB130和260205根中PvARP1基因表達(dá)量顯著或極顯著高于其他激素處理，感病材料BRB130的表達(dá)量在72 h達(dá)到最高，上升至處理0 h表達(dá)量的57倍，抗病材料260205基因表達(dá)量在處理96 h達(dá)到最大，上升至處理0 h表達(dá)量的92倍。SA、JA處理48 h和72 h的基因表達(dá)量略有升高(圖4)。上述結(jié)果表明，IAA是PvARP1基因參與的抗病信號傳導(dǎo)途徑中的重要因子，而其他植物激素在PvARP1基因參與調(diào)節(jié)的防御反應(yīng)中并不發(fā)揮關(guān)鍵作用。

*代表同一接種時(shí)間BRB130與260205之間的表達(dá)水平差異顯著(P<0.05)

2.3.3 普通菜豆生長素調(diào)節(jié)蛋白PvARP1基因不同組織表達(dá)量分析 qRT-PCR分析結(jié)果表明，生長素調(diào)節(jié)蛋白PvARP1基因在普通菜豆根、莖、葉、花、莢中均有不同程度表達(dá)(圖5)。菜豆花和莢中PvARP1基因表達(dá)量明顯高于根、莖和葉中的表達(dá)量。以根中PvARP1基因表達(dá)量為參照，抗病材料260205莖和花中的表達(dá)量顯著和極顯著高于感病材料BRB130，根、葉、莢中的表達(dá)量沒有顯著差異。PvARP1基因在抗病材料260205花中表達(dá)量最高，可達(dá)根中表達(dá)量的53倍。

*和**分別代表同一處理時(shí)間BRB130與260205不同處理

*和**分別代表BRB130與260205在同一器官中表達(dá)水平差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)

2.4 普通菜豆生長素調(diào)節(jié)蛋白基因PvARP1原核表達(dá)分析

本研究中，PvARP1重組表達(dá)蛋白以無活性的包涵體沉淀形式存在。將包涵體蛋白溶解于8 mmol/L尿素溶液，采用鎳柱親和層析技術(shù)純化重組蛋白，通過透析技術(shù)逐漸降低蛋白質(zhì)溶液中尿素濃度，獲得復(fù)性的PvARP1重組蛋白。通過SDS-PAGE電泳驗(yàn)證重組蛋白純化效果與分子質(zhì)量，得到融合表達(dá)蛋白6×His-PvARP1的單一條帶，重組蛋白分子質(zhì)量約為68 ku，與PvARP1基因預(yù)測編碼蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量一致(圖6)。

1.純化的PvARP1重組蛋白；M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

2.5 普通菜豆生長素調(diào)節(jié)蛋白基因PvARP1表達(dá)重組蛋白活性測定

如圖7所示，在PvARP1重組蛋白的作用下，IAA逐漸被氨基化合成IAA-Asp(天冬酰吲哚乙酸)和IAA-Ala(丙氨酰吲哚乙酸)。IAA的初始濃度為1 mmol/L，反應(yīng)開始后IAA濃度逐漸降低，反應(yīng)30 min后，IAA的濃度降低至0.2 mmol/L。反應(yīng)產(chǎn)物IAA-Asp和IAA-Ala的濃度隨著反應(yīng)進(jìn)行逐漸升高。30 min后，IAA-Asp的濃度達(dá)到0.6 mmol/L，IAA-Ala濃度為0.17 mmol/L。上述結(jié)果表明，PvARP1編碼蛋白質(zhì)具有酰胺合成酶活性，在PvARP1重組蛋白的催化下具有活性的IAA被轉(zhuǎn)化為無活性化合態(tài)，從而降低了植物細(xì)胞內(nèi)游離IAA濃度，激發(fā)了IAA參與的寄主抗病相關(guān)反應(yīng)。

*代表同一反應(yīng)時(shí)間濃度差異顯著(P<0.05)

3 結(jié)論與討論

本研究將從前期構(gòu)建的普通菜豆與鐮孢菌枯萎病原菌互作的cDNA-AFLP差異顯示文庫中獲得的1個(gè)EST片段作為“種子”序列(該片段序列與大豆生長素調(diào)節(jié)蛋白GH3基因相似性達(dá)80%)，應(yīng)用PCR技術(shù)從普通菜豆260205中分離出生長素調(diào)節(jié)蛋白基因PvARP1的cDNA全長序列，其編碼的蛋白質(zhì)與鐮孢菌枯萎病抗病性相關(guān)。植物生長素不但與植物生長和發(fā)育密切相關(guān)，同時(shí)也參與調(diào)節(jié)植物對病原菌的抗性反應(yīng)[9，17-19]。擬南芥生長素敏感突變體dth9對幾種不同病原菌的侵染更加敏感，而生長素敏感突變體增強(qiáng)了植株對病原物的抗性[5-7]。盡管有研究表明，病原生長素可作為侵染植物的毒性因子[6-7，19-22]，但關(guān)于其在病原物侵染過程中的分子功能以及與植物防御系統(tǒng)互作的相關(guān)報(bào)道仍然較少。

SA和JA信號途徑調(diào)節(jié)許多植物對不同病原物的防御反應(yīng)[24]。O′DONNELL等[21]研究表明，擬南芥應(yīng)答野油菜黃單胞菌侵染時(shí)，其體內(nèi)IAA等激素水平的變化與SA并無直接聯(lián)系。擬南芥IAA信號途徑的轉(zhuǎn)錄因子AtARF6和AtARF8能夠顯著提高JA含量，表明生長素介導(dǎo)植物抗性不需要激活依賴JA的抗病信號傳導(dǎo)途徑[25]。前人研究顯示，基礎(chǔ)抗性和R基因介導(dǎo)的抗性可能存在重疊，導(dǎo)致形成了防御信號途徑互相交叉的網(wǎng)絡(luò)[26-27]，DING等[9]研究結(jié)果表明，水稻中IAA參與的白葉枯病抗病信號傳導(dǎo)途徑是獨(dú)立的，并不依賴SA和JA介導(dǎo)的植物抗病反應(yīng)，而IAA、SA、JA 3種信號途徑也存在相互作用。本研究結(jié)果表明，PvARP1基因能夠被枯萎病病原菌顯著誘導(dǎo)表達(dá)(P<0.05)，而且受外源IAA誘導(dǎo)表達(dá)量明顯升高，其他外源植物激素處理對基因表達(dá)量沒有顯著影響，但SA誘導(dǎo)下表達(dá)量略有提高，表明IAA可能參與菜豆對枯萎病菌的抗病反應(yīng)，并不需要直接依靠其他類型激素參與的信號傳導(dǎo)途徑，而不同激素信號途徑可能存在相互作用。不同組織表達(dá)量分析結(jié)果表明，花和莢中PvARP1基因表達(dá)量明顯高于根、莖和葉中的表達(dá)量(P<0.05)。

NAVARRO等[6]研究顯示，超量表達(dá)生長素受體使生長素合成量增加，提高了植株對病原菌的敏感性，相反，通過RNA干擾技術(shù)抑制生長素受體的合成，從而抑制生長素信號的傳導(dǎo)，提高了植株對病原菌的抗性。KIDD等[12]證明，生長素介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑激發(fā)了擬南芥對鐮孢菌枯萎病原菌的感病性，病原菌通過色氨酸途徑誘導(dǎo)寄主IAA的過量合成，從而使寄主更易感病。上述結(jié)果表明，生長素提高了植物對病原物的敏感性。水稻生長素調(diào)節(jié)蛋白GH3-8可以氨?；疘AA，調(diào)節(jié)植物體內(nèi)IAA的含量，從而抑制了水稻表皮細(xì)胞壁中α-伸展蛋白和β-伸展蛋白的合成，阻止了細(xì)胞壁松弛，形成天然屏障，抑制病原菌在水稻中生長和繁殖[9]。此外，相關(guān)研究還表明，通過激活GH3類蛋白質(zhì)抑制生長素信號增強(qiáng)了對細(xì)菌病原物的抗性，增強(qiáng)的抗性可能和激活了PR-1基因的表達(dá)有關(guān)[28-29]。本研究結(jié)果表明，PvARP1基因的重組表達(dá)蛋白在體外試驗(yàn)中具有酰胺合成酶活性，能將IAA轉(zhuǎn)化為無活性化合態(tài)IAA-AA，說明PvARP1可能通過調(diào)節(jié)植物生長素的合成和代謝從而正向地調(diào)控植物對枯萎病病原菌的防御反應(yīng)。