宋雨光 王碩 趙艷杰 姜妮 喬國良 趙靜 邸巖 王小莉 任軍

根據(jù)2018年全球腫瘤發(fā)病率以及死亡率統(tǒng)計(jì)，肺癌仍然是全球發(fā)病率以及死亡率最高的癌種，新診斷的數(shù)量占所有癌種數(shù)的11.6%，死亡人數(shù)占所有癌種中第一位[1]，而在亞洲地區(qū)，尤其是在中國，在所有腫瘤中肺癌的數(shù)量仍然高居第一名。其中非小細(xì)胞肺癌（nonsmall cell lung cancer, NSCLC）在肺癌中占比高達(dá)80%，肺癌患者中約55%的病例在就診時(shí)已經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，5年生存率僅為10%-15%。最近十幾年里，表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptortyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs）等相應(yīng)靶向藥物已經(jīng)成為晚期非小細(xì)胞肺腺癌重要的治療方式之一，且已有多項(xiàng)臨床研究[2]證實(shí)TKI的靶向治療能顯著降低伴有EGFR基因突變的晚期NSCLC患者疾病進(jìn)展或死亡風(fēng)險(xiǎn)、改善患者生活質(zhì)量；對有EGFR敏感突變且對一代TKI治療有效的患者中位無進(jìn)展生存期為10個(gè)月-16個(gè)月[3]；但是第一代TKI的耐藥一直是臨床難以解決的問題，目前已有相關(guān)研究[4]認(rèn)為耐藥的主要原因是T790M基因改變的結(jié)果[5]，而三代TKI奧希替尼的成功上市解決了部分T790M基因突變所致耐藥的問題，而除此以外，還有一些基因，比如ERBB2、ERBB3等表達(dá)的蛋白擴(kuò)增；BRAF、MAP2K1、PI3KCA以及KRAS基因的錯(cuò)義突變；PTEN基因的失活和ALK融合基因的表達(dá)都會(huì)對TKI治療EGFR突變的患者產(chǎn)生影響，最終導(dǎo)致耐藥從而病情進(jìn)展[6]。而一些研究[7]中，研究者通過采取應(yīng)用TKI治療EGFR突變肺癌患者不同時(shí)間段的外周血，通過cfDNA的基因檢測發(fā)現(xiàn)12例患者中6例患者T790M在治療過程中逐漸升高，而其余的患者沒有發(fā)現(xiàn)T790M基因的產(chǎn)生，2例患者中出現(xiàn)了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換（epithelialmesenchymal transition, EMT）現(xiàn)象，而其中的1例有RB1失活，1例RB1基因出現(xiàn)突變；這說明每一例患者獲得性耐藥的機(jī)制都是不同的，而在腫瘤發(fā)生的不同時(shí)間，基因的變化也是不盡相同的。

為了更好地解決上述問題，我們需要在治療過程中檢測患者的基因水平的變化，明確有無新的耐藥基因的產(chǎn)生，同時(shí)通過基因水平的變化檢測TKI治療的療效，但是在治療進(jìn)展后很難應(yīng)用傳統(tǒng)的穿刺方式來獲得患者的病理組織。循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA,ctDNA）測序技術(shù)的發(fā)展給上述問題帶來了很好的解決方案。對比前后的ctDNA突變變化可以作為一個(gè)潛在TKI治療效果的指標(biāo)[8]。

基于此，我們應(yīng)用ctDNA測序技術(shù)比較應(yīng)用TKI治療前后的基因譜組成以及突變頻率變化，從而預(yù)測TKI治療的療效。同時(shí)我們觀察到一些新發(fā)的耐藥基因產(chǎn)生，比如T790M、P53、JAK等從而影響TKI治療的療效。

1 資料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 我們進(jìn)行了一項(xiàng)前瞻性單中心研究，以測試ctDNA在評估EGFR突變NSCLC患者治療反應(yīng)和監(jiān)測EGFR狀態(tài)的有效性。入組合格標(biāo)準(zhǔn)包括具有EGFR突變的肺腺癌、年齡18歲-75歲，體力狀況（performance status, PS）評分0分-2分，臨床分期IIIb期或IV期患者。并簽署書面知情同意書及同意用TKI治療的患者；排除標(biāo)準(zhǔn)：PS評分>2分，年齡>75歲及選擇TKI治療以外治療的患者。2016年11月-2018年8月，共有22例患者參與了這項(xiàng)研究。每例患者根據(jù)自愿接受三種已在中國上市的TKI藥物中的任何一種（易瑞沙，特羅凱；凱美納），在EGFR-TKI治療期間，患者外周血液樣本（每8 mL）分別在治療前1周及治療后2個(gè)月及臨床評效進(jìn)展后分別各采集一次進(jìn)行ctDNA測序分析應(yīng)用。腫瘤對治療的反應(yīng)是通過計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography,CT）確定的，并根據(jù)實(shí)體瘤療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors, RECIST）進(jìn)行評估，分為完全緩解（complete response, CR）、部分緩解（partial response, PR）、穩(wěn)定（stable disease, SD）以及病情進(jìn)展（progressive disease, PD）。

1.2 血漿樣品處理與ctDNA提取 用EDTA真空采血管（BD Diagnostics, Franklin Lakes, NJ, USA）采集患者8 mL外周血并在4 h內(nèi)完成血漿分離。血漿中ctDNA的提取使用的是QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit（Qiagen,Hilden, Germany）。DNA濃度的檢測使用QubitdsDNAHS（High Sensitivity）Assay Kit（Invitrogen, Carlsbad, CA,USA），并利用Agilent 2100 BioAnalyzer and the DNA HS kit（AgilentTechnologies, Santa Clara, CA, USA）檢測ctDNA的片段分布。

1.3 ctDNA測序范圍 體細(xì)胞變異基因檢測范圍包含全部外顯子區(qū)域基因（288個(gè)基因的4,728個(gè)外顯子）；其他相關(guān)基因728個(gè)基因的1,074 個(gè)編碼區(qū)域。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析都是基于Graphpad Prism軟件獲得，ctDNA突變頻率變化采用同一患者治療前后對比配對t檢驗(yàn)所獲得，P＜0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Kaplan-Meier方法進(jìn)行生存分析。應(yīng)用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，應(yīng)用Graphpad Prism軟件繪圖。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，兩組間比較采用卡方檢驗(yàn)，我們應(yīng)用Cox比例回歸模型進(jìn)行無進(jìn)展生存時(shí)間（progression free survival, PFS）的評估，采用單因素變量即一次采用一個(gè)因子，然后任何所有因素的多變量模型來分析潛在預(yù)后變量。

2 結(jié)果

2.1 患者臨床特征 參加本試驗(yàn)研究的22例患者中半數(shù)患者（50%）應(yīng)用吉非替尼治療，其余依據(jù)患者意愿6例應(yīng)用厄洛替尼，5例應(yīng)用?？颂婺嶂委煛Ｖ委熐昂笫占送庵苎M(jìn)行循環(huán)腫瘤DNA測序，22例患者詳細(xì)信息如表1所示， 本試驗(yàn)入組患者中位年齡為63歲（范圍44歲-94歲），入組女性患者占絕大多數(shù)，其中18例患者的體力狀況較好（PS=0分或1分）。治療前的測序結(jié)果是EGFR 21位點(diǎn)突變14例，EGFR 19位點(diǎn)缺失突變5例。

2.2 基因突變情況 治療中1例患者出現(xiàn)T790M突變，1例患者出現(xiàn)L861Q突變，7例患者出現(xiàn)TP53基因伴隨突變，2例患者出現(xiàn)JAK2伴隨突變。隨訪2個(gè)月時(shí)5例PD，6例SD，PR及CR共11例；24個(gè)月隨訪結(jié)果2例CR，20例PD，其中死亡9例。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果如圖1所示22例患者基于外周血檢測的EGFR突變所應(yīng)用靶向藥物治療后中位PFS為390 d（范圍：40 d-1,500 d），而這也與組織學(xué)檢測結(jié)果后應(yīng)用靶向藥物治療時(shí)間相似（吉非替尼13.7個(gè)月，厄洛替尼14個(gè)月）（圖1）。

2.3 對比前后外周血中ctDNA中EGFR突變基因豐度變化及出現(xiàn)其他伴隨突變可以預(yù)測靶向藥物治療療效 為了解循環(huán)血中ctDNA是否可以預(yù)測靶向藥物治療療效，我們將22例患者服用靶向藥物后2個(gè)月或臨床進(jìn)展后再次抽取了外周血行ctDNA測序，從圖2中我們看出相比治療前，15例患者應(yīng)用靶向藥物治療后出現(xiàn)了EGFR突變頻率豐度明顯下降（P=0.015,3），其PFS明顯延長，達(dá)630 d，P=0.042，通過基因檢測發(fā)現(xiàn)具有TP53及JAK2伴隨突變的患者預(yù)后較差。如圖3所示，如果患者伴隨TP53突變的情況下相比未伴隨突變生存期明顯降低（中位PFS為160 d vs 630 d，P=0.000,2）。JAK2突變因數(shù)量較少，未給予統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。如圖4所示，其中7例患者再檢測時(shí)EGFR基因豐度變化不大，P=0.67，臨床評效多為穩(wěn)定。在有TP53突變的患者，隨著TKI的治療，其豐度逐漸升高，且臨床療效較差，提示本部分患者可能先天對TKI耐藥（圖2-圖4）。

表1 22例患者的臨床特征比較Tab 1 The comparison of clinical features in 22 cases

3 討論

目前已有較多的研究證明了在NSCLC治療中，可以基于ctDNA的癌癥基因突變的結(jié)果給予靶向治療。有研究[8]中65%的患者存在ctDNA突變，并給予有針對性的治療方案，包括26%的患者可以行動(dòng)態(tài)的癌癥基因檢測。有研究[9]于2017年在《Nature》上發(fā)表了一篇回顧性文章，其分析了100例NSCLC術(shù)后的患者，采用游離DNA方法預(yù)測治療效果，結(jié)果ctDNA對復(fù)發(fā)的預(yù)測敏感性是93%，能夠比傳統(tǒng)影像及腫瘤標(biāo)志物等檢測方法早11個(gè)月發(fā)現(xiàn)進(jìn)展。

圖1 EGFR敏感突變組的中位平均生存期。Fig 1 Median survival time of EGFR sensitive mutation group

圖2 治療前后EGFR突變基因豐度變化圖Fig 2 The comparative abundance of EGFR sensitive mutation before and after treatment

圖3 伴有或不伴有TP-53伴隨突變患者的PFSFig 3 Progression-free survival of cases with or without TP53 mutation

圖4 EGFR及TP-53突變基因治療前后豐度變化圖Fig 4 The comparative abundances of EGFR and TP-53 mutation before and after treatment

在癌癥患者血漿中檢測到攜帶腫瘤特異性序列改變的DNA片段，即ctDNA目前被認(rèn)為是組織活檢的合理補(bǔ)充[10]。最近，ctDNA在監(jiān)測腫瘤負(fù)擔(dān)、最小殘留疾病和獲得性耐藥中的作用正在深入研究中，在Abbosh等[11]的報(bào)告中，ctDNA的變化和EGFR-TKI治療的臨床反應(yīng)之間有良好的相關(guān)性。然而，具有EGFR激活突變的腫瘤是由含有多種EGFR基因等位基因組合的異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞克隆組成的，包括激活突變體、野生型和原發(fā)T790M突變型[12]，它們的比值在EGFR-TKI治療過程中隨時(shí)間變化。因此，動(dòng)態(tài)監(jiān)測ctDNA變化可以觀察到對EGFR-TKI的反應(yīng)，并及時(shí)反映出每個(gè)克隆的變化。此外，EGFR-TKI的治療對EGFR基因的影響無疑會(huì)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的克隆進(jìn)化，如果是這樣的話，ctDNA將為我們提供一個(gè)工具來觀察腫瘤的克隆結(jié)構(gòu)和它們隨時(shí)間進(jìn)化的動(dòng)態(tài)，并可以作為評估對治療或耐藥性發(fā)展的反應(yīng)。在我們的研究中，可以看出EGFR-TKI治療過程中有多基因片段ctDNA的動(dòng)態(tài)變化，而這些基因的動(dòng)態(tài)變化，對藥物敏感突變頻率豐度下降預(yù)示著治療有效，通過上述試驗(yàn)結(jié)果我們初步認(rèn)為ctDNA特定靶點(diǎn)的基因突變頻率豐度變化可以預(yù)示靶向治療的療效。

在我們的研究發(fā)現(xiàn)在2例患者治療中出現(xiàn)JAK2（p.V617F）基因突變，約占測試的1%病例。在肺癌的治療中，JAK-STAT途徑的作用得到越來越多的人認(rèn)識[13]。有研究[14]描述JAK-STAT途徑的活動(dòng)：有EGFR突變的患者在給與TKI治療中，尤其在出現(xiàn)EGFR-TKI抵抗時(shí)，常出現(xiàn)JAK2伴隨突變，此時(shí)給與JAK2抑制劑后，能使耐藥細(xì)胞再次對TKI治療有效。而TP53基因的伴隨突變在許多研究中亦有報(bào)道，可以影響EGFR靶向治療的療效[15,16]。有研究[17]在105例患者中發(fā)現(xiàn)了43例TP54/EGFR雙突變患者（占所有檢測的41%）。其PFS和OS的縮短都與TP53狀態(tài)有關(guān)。在Shepherd[18]的研究中納入60個(gè)晚期肺腺癌患者，其中24個(gè)是TP53突變型；36 例TP53野生型，在獲得第一代EGFR TKI治療后，觀察到在EGFR TKI和TP53突變（HR=1.74, 95%CI: 0.98-3.10, P=0.06）之間有一個(gè)不顯著的影響趨勢，TP53突變（n=17）時(shí)，PFS顯著縮短（HR=1.91, 95%CI: 1.01-3.60, P=0.04）；但在后續(xù)在使用T790M抑制劑治療的11例可評估患者中，沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異（TP53/3: 100%, WT 7/8: 88%）。其結(jié)論認(rèn)為雙TP53/EGFR突變的患者，在接受EGFR TKI治療時(shí)，反應(yīng)率降低，PFS的縮短。我們的研究雖然樣本量較小，但也看出同樣的趨勢。

通過以上研究我們認(rèn)為通過NGS液體活檢方法，檢測EGFR的ctDNA變化，可以較準(zhǔn)確的反映出EGFG敏感突變的NSCLC對酪氨酸激酶抑制劑的治療效果，其敏感基因突變豐度的快速降低可能預(yù)示著預(yù)后良好。而通過這種測序手段我們也能監(jiān)測治療過程中腫瘤的空間異質(zhì)性變化，那些臨床評效為PR/CR的病例，其敏感突變的豐度快速減低，可能預(yù)示著腫瘤細(xì)胞以單一EGFR突變克隆為主；臨床評效為SD/PD的病例，其敏感豐度變化不大或反而升高及伴隨較多其他突變，預(yù)示著癌癥細(xì)胞的克隆較多。我們后續(xù)將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量來進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)論，并隨著其他相關(guān)基因通路的研究結(jié)果，根據(jù)ctDNA的檢測結(jié)果制定更加精準(zhǔn)的腫瘤個(gè)體化治療方案，并為EGFR-TKI治療耐藥后的其他治療提供依據(jù)。