呂觀 常彥磊 石磊

（暨南大學(xué)食品安全與營養(yǎng)研究院，廣東 廣州 510632）

摘 要：建立免疫磁珠分離（immunomagnetic separation，IMS）聯(lián)合環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)檢測牛肉中鼠傷寒沙門氏菌與金黃色葡萄球菌的方法。用生物素標(biāo)記的鼠傷寒沙門氏菌抗體和生物素標(biāo)記的金黃色葡萄球菌菌體蛋白抗體對鏈霉親和素磁珠進(jìn)行功能化，從牛肉中捕獲和分離目標(biāo)致病菌。結(jié)果表明：經(jīng)優(yōu)化后，每毫克磁珠與10 ?L鼠傷寒沙門氏菌抗體偶聯(lián)，400 ?L鼠傷寒沙門氏菌免疫磁珠在45 min內(nèi)對104 CFU/mL鼠傷寒沙門氏菌的捕獲率為52.16%;每毫克磁珠與6 ?L金黃色葡萄球菌抗體偶聯(lián)，300 ?L金黃色葡萄球菌免疫磁珠在30 min內(nèi)對104 CFU/mL金黃色葡萄球菌的捕獲率為56.80%;建立的IMS-LAMP方法特異性高，對牛肉中鼠傷寒沙門氏菌的檢測靈敏度為1.2×103 CFU/mL，對金黃色葡萄球菌的檢測靈敏度為4.4×104 CFU/mL;富集5 h后，鼠傷寒沙門氏菌的檢測限可至1.2 CFU/mL，富集7 h后，金黃色葡萄球菌的檢測限可降至4.4 CFU/mL。建立的IMS-LAMP方法用時短，靈敏度高，操作簡單，可以有效檢測牛肉中的鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌。

關(guān)鍵詞：鼠傷寒沙門氏菌;金黃色葡萄球菌;免疫磁珠;環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增;牛肉

Rapid Detection of Salmonella typhimurium and Staphylococcus aureus in Beef by Immunomagnetic Separation Combined with Loop-Mediated IsothermaL Amplification Method

L? Guan， CHANG Yanlei， SHI Lei*

（Institute of Food Safety and Nutrition， Jinan University， Guangzhou 510632， China）

Abstract： A method combining immunomagnetic separation （IMS） and loop-mediated isothermal amplification （LAMP） was developed to detect Salmonella typhimurium and Staphylococcus aureus in beef. Streptavidin magnetic beads were functionalized with biotin-labeled Salmonella typhimurium antibodies and biotin-labeled Staphylococcus aureus protein antibodies to capture and isolate the target pathogen from beef. After optimization， 400 ?L of immunomagnetic beads （IMBs） conjugated with 10 ?L/mg of anti-Salmonella typhimurium antibody presented a capture efficiency of 52.16% for 104 CFU/mL

of Salmonella typhimurium within 45 min， and 300 ?L of IMBs conjugated with 6 ?L/mg of anti-Staphylococcus aureus antibody presented a capture efficiency of 56.80% for 104 CFU/mL of Staphylococcus aureus within 30 min. The proposed IMS-LAMP had a high specificity. When applied on beef， the detection limit was about 1.2 × 103 CFU/mL for Salmonella typhimurium and 4.4 × 104 CFU/mL for Staphylococcus aureus in beef. After 5 and 7 h of enrichment， the detection limit of Salmonella typhimurium and Staphylococcus aureus was improved to 1.2 and 4.4 CFU/mL， respectively. Hence， the IMS-LAMP assay provides a rapid， simple， and highly sensitive method for the detection of Salmonella typhimurium and Staphylococcus aureus in beef.

Keywords： Salmonella typhimurium; Staphylococcus aureus; immunomagnetic separation; loop-mediated isothermal amplification; beef

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190612-124

中圖分類號：TS207.4? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2019）07-0042-07

引文格式：

呂觀， 常彥磊， 石磊. 免疫磁珠-環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增快速檢測牛肉中的鼠傷寒沙門氏菌與金黃色葡萄球菌[J]. 肉類研究， 2019， 33（7）： 42-48. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190612-124.? ? http：//www.rlyj.net.cn

L? Guan， CHANG Yanlei， SHI Lei. Rapid detection of Salmonella typhimurium and Staphylococcus aureus in beef by immunomagnetic separation combined with loop-mediated isothermal amplification method[J]. Meat Research， 2019， 33（7）： 42-48. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190612-124.? ? http：//www.rlyj.net.cn

目前，98.5%食源性疾病的起因是微生物污染，而沙門氏菌和金黃色葡萄球菌就是2 種市面上常見的食源性致病菌[1]。沙門氏菌屬于兼性厭氧革蘭氏陰性菌，是造成人類腸胃炎爆發(fā)的主要原因之一[2]。金黃色葡萄球菌屬于革蘭氏陽性菌，能產(chǎn)生多種腸毒素，引發(fā)人類皮膚和軟組織感染，導(dǎo)致敗血癥和肺炎等疾病[3-4]。這2 種病菌常存在于生肉[5]、雞蛋[6]、水果[7]和蔬菜[8]中，人類食用被這2 種病菌污染的食品會引發(fā)一系列的食品安全問題，嚴(yán)重威脅人類的生命健康。

官方的食品安全機(jī)構(gòu)對這2 種食源性致病菌的檢測仍采用國家標(biāo)準(zhǔn)，主要包括預(yù)富集、選擇性富集、選擇性瓊脂分離結(jié)合菌落的生物化學(xué)表征最終確認(rèn)[9-10]。傳統(tǒng)方法的優(yōu)點是操作簡便、價格便宜、設(shè)備簡單，但需要5～10 d不等，對人員的專業(yè)經(jīng)驗要求高、靈敏性差、無法快速檢測、在等待測試結(jié)果的過程中可能會對經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)活動產(chǎn)生強(qiáng)烈的負(fù)面影響，故市場上急需一種快速、準(zhǔn)確的檢測方法[11-12]。

免疫磁珠分離（immunomagnetic separation，IMS）技術(shù)是目前一種運(yùn)用廣泛的前處理方法，能夠縮短微生物檢測的增菌時間、消除食品基質(zhì)的影響、實現(xiàn)微生物致病菌的快速富集[13]。該方法利用磁珠上的抗體與食品基質(zhì)中的抗原發(fā)生特異性結(jié)合后，在磁力的吸附下，將致病菌分離出來[14]。環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是由Notomi等[15]提出的一種新型恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)利用4～6 條特異性引物和一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶對核酸進(jìn)行擴(kuò)增，有效避免了對溫度和儀器的要求，其特異性強(qiáng)、靈敏度高、實驗步驟簡單、不需要專業(yè)的技術(shù)人員，適用于食源性致病菌的快速檢測[16]。本研究將IMS技術(shù)與LAMP技術(shù)相結(jié)合，針對牛肉中的鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌2 種食源性致病菌，利用免疫磁珠富集致病菌，同時選擇鼠傷寒沙門氏菌的invA基因和金黃色葡萄球菌的nuc基因作為靶基因構(gòu)建實時熒光LAMP體系，進(jìn)而建立準(zhǔn)確、快速檢測牛肉中鼠傷寒沙門氏菌與金黃色葡萄球菌的IMS-LAMP方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）ATCC14028、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC25923、蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）CMCC63303、阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）ATCC29544、大腸桿菌O157：H7（Escherichia coli O157：H7）ATCC35150、單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）ATCC19115和副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）ATCC17802 廣州環(huán)凱微生物科技有限公司。

鏈霉親和素磁珠（500 nm） 上海羧菲生物醫(yī)藥科技有限公司;生物素標(biāo)記的沙門氏菌抗體、生物素標(biāo)記的金黃色葡萄球菌菌體蛋白抗體 北京博奧森生物技術(shù)有限公司;營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 美國HyClone公司;吐溫-20 天津市大茂化學(xué)試劑廠;Bst DNA聚合酶? ?紐英倫生物技術(shù)（北京）有限公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司;甜菜堿、dNTPs、MgSO4·7H2O 美國Sigma公司;SYTO-9熒光染料?英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司;引物 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7500熒光定量PCR儀 美國ABI（Applied Biosystem）公司;HS-3垂直混合儀 寧波新芝生物科技股份有限公司;奧磁?多功能磁分離器 上海奧潤微納新材料科技有限公司;微量移液槍（0.1～1.0 mL） 塞默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的培養(yǎng)

將甘油保存的鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌分別在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h;用接種環(huán)挑取各自單個典型單菌落于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在37 ℃、150 r/min的搖床中培養(yǎng)18～24 h;取1 mL培養(yǎng)好的鼠傷寒沙門氏菌菌液和金黃色葡萄球菌菌液于試管中，分別加入9 mL磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST，0.01 moL/L PBS，pH 7.2，體積分?jǐn)?shù)0.05%的吐溫-20）進(jìn)行10 倍梯度稀釋，用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)計數(shù)。

1.3.2 免疫磁珠捕獲率的計算

按照下式計算免疫磁珠捕獲率[17]。

式中：CE為捕獲率/%;C0為總菌落數(shù)/（CFU/mL）;

Ca為磁分離后上清液中的菌落數(shù)/（CFU/mL）。

1.3.3 免疫磁珠富集條件優(yōu)化

1.3.3.1 免疫磁珠的制備

吸取50 ?L的500 nm鏈霉親和素磁珠（20 mg/mL）于1.5 mL滅菌離心管中，顛倒混勻PBS中的鏈霉親和素磁珠，洗滌磁珠，在磁力架上進(jìn)行磁場吸附，棄上清液;將磁珠重懸于1 mL 0.01 mol/L PBST，加入適量的含生物素標(biāo)記的鼠傷寒沙門氏菌抗體和金黃色葡萄球菌的多克隆抗體，在垂直混勻儀上輕柔振蕩，在室溫下孵育45 min;再進(jìn)行磁場吸附，棄去上清液;加入0.01 mol/L PBST（每次1 mL）洗滌磁珠3 次，每次5 min，磁場吸附，棄去上清液;最后將磁珠重懸在1 mL含有0.02 g/100 mL Na3N和0.1 g/100 mL牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的PBST中，用于后續(xù)實驗，免疫磁珠保存于4 ℃冰箱。

1.3.3.2 磁珠與抗體投料比的確定

吸取50 ?L的500 nm鏈霉親和素磁珠（20 mg/mL）于1.5 mL滅菌離心管中，顛倒混勻PBS中的鏈霉親和素磁珠，洗滌磁珠，在磁力架上進(jìn)行磁場吸附，棄上清液;將磁珠重懸于1 mL 0.01 mol/L PBST，分別加入2、6、10、20、30、40、50、60 ?L含生物素標(biāo)記的鼠傷寒沙門氏菌抗體和金黃色葡萄球菌的多克隆抗體，其磁珠與抗體的投料比分別100∶0.2、100∶0.6、100∶1.0、100∶2.0、100∶3.0、100∶4.0、100∶5.0、100∶6.0（m/m），在垂直混勻儀上輕柔振蕩，在室溫下孵育45 min;再進(jìn)行磁場吸附，棄去上清液;加入0.01 mol/L PBST（每次1 mL）洗滌磁珠3 次，每次5 min，磁場吸附，棄去上清液;最后將磁珠重懸在1 mL含有0.02 g/100 mL Na3N和0.1 g/100 mL BSA的PBST中。

分別投入制備好的免疫磁珠300 ?L混勻，將其置于磁力架上5 min使磁珠充分吸附后，將上清液移除;分別取1 mL 104 CFU/mL的鼠傷寒沙門氏菌菌液和金黃色葡萄球菌菌液于已加免疫磁珠的1.5 mL離心管中，垂直混勻儀上室溫孵育45 min后，將其置于磁力架上5 min使磁珠充分吸附后，將上清液移至新的離心管中，取100 ?L上清液涂于營養(yǎng)瓊脂平板，37 ℃過夜培養(yǎng)后觀察結(jié)果，進(jìn)行菌落計數(shù)并計算吸附效率，每個樣品3 個平行。

1.3.3.3 免疫磁珠最適添加量的確定

分別投入制備好的免疫磁珠50、100、200、300、400、500、600 ?L于1.5 mL離心管中，將其置于磁力架上5 min使磁珠充分吸附后，將上清液移除;分別取1 mL 104 CFU/mL的鼠傷寒沙門氏菌菌液和金黃色葡萄球菌菌液于已加免疫磁珠的1.5 mL離心管中，混勻;在垂直混勻儀上室溫孵育45 min后，將其置于磁力架上5 min使磁珠充分吸附后，將上清液移至新的離心管中;取100 ?L上清液涂于營養(yǎng)瓊脂平板，37 ℃過夜培養(yǎng)后觀察結(jié)果，進(jìn)行菌落計數(shù)并計算吸附效率，每個樣品3 個平行。

1.3.3.4 免疫磁珠與菌液最佳反應(yīng)時間的確定

分別取1 mL 104 CFU/mL的鼠傷寒沙門氏菌菌液和金黃色葡萄球菌菌液于1.5 mL離心管中，分別投入已經(jīng)確定的免疫磁珠最適加入量，混勻;在垂直混勻儀上分別室溫孵育5、15、30、45、60 min后，將其置于磁力架上5 min使磁珠充分吸附后，將上清液移至新的離心管中;取100 ?L上清液涂于營養(yǎng)瓊脂平板，37 ℃過夜培養(yǎng)后觀察結(jié)果，進(jìn)行菌落計數(shù)并計算吸附效率，每個樣品3 個平行。

1.3.3.5 免疫磁珠的使用

投入適量制備好的免疫磁珠，混勻，將其置于磁力架上5 min使磁珠充分吸附后，將上清液移除;取1 mL菌液于已加免疫磁珠的1.5 mL離心管中，在垂直混勻儀上室溫孵育最適時間后，將其置于磁力架上5 min使磁珠充分吸附后，將上清液移除，重復(fù)洗滌3 次，加入1 mL 0.01 mol/L PBS振蕩重懸磁珠，得到的致病菌-磁珠復(fù)合物用于后續(xù)的LAMP檢測。

1.3.4 LAMP檢測體系

1.3.4.1 DNA模板制備及引物的合成

樣品中的鼠傷寒沙門氏菌與金黃色葡萄球菌經(jīng)過各自的免疫磁珠富集分離后，參照DNA提取試劑盒的說明書制備DNA模板，-20 ℃保存。選取鼠傷寒沙門氏菌的invA基因和金黃色葡萄球菌的nuc基因設(shè)計引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列如表1所示。

1.3.4.2 LAMP反應(yīng)體系

LAMP反應(yīng)體系為25 μL，各成分為：外引物（F3和B3）各0.2 μmol/L、內(nèi)引物（FIP和BIP）各1.6 μmol/L、

環(huán)引物（LoopF和LoopB）各0.8 μmol/L、dNTPs濃度1.4 mmol/L、甜菜堿濃度0.8 mmol/L、Mg2+濃度8.0 mmol/L、SYTO-9熒光染料0.5 μL、Bst DNA聚合酶8 U、DNA模板2 μL，超純水補(bǔ)充體積至25 μL，加石蠟油進(jìn)行密封。LAMP反應(yīng)在7500熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀上進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)程序為：63 ℃、30 s，預(yù)變性;63 ℃、15 s，63 ℃、45 s，共45 個循環(huán)，每個循環(huán)結(jié)束后收集熒光信號。

1.3.5 IMS-LAMP方法的特異性檢測

利用本研究建立的鼠傷寒沙門氏菌IMS-LAMP法和金黃色葡萄球菌IMS-LAMP法對鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌、阪崎腸桿菌、大腸桿菌O157：H7、單核細(xì)胞增生李斯特菌和副溶血性弧菌進(jìn)行檢測，菌液濃度均為104 CFU/mL，根據(jù)曲線結(jié)果判定該方法的特異性。

1.3.6 人工污染牛肉中鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的檢測

實驗所用牛肉從當(dāng)?shù)厥袌霁@取，并通過國標(biāo)法

（GB 4789.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗》和GB 4789.10—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》）鑒定出不含沙門氏菌和金黃色葡萄球菌。將過夜培養(yǎng)的鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌進(jìn)行梯度稀釋，培養(yǎng)后進(jìn)行平板計數(shù);各取1 mL已知菌液濃度的鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌菌液，加入到25 g牛肉樣品中，每個樣品均與225 mL的營養(yǎng)肉湯混合，樣品均質(zhì)化后，使2 種致病菌的濃度為100～105 CFU/mL;沒有添加致病菌的牛肉樣品作為陰性對照，用本研究建立的2 種菌的IMS-LAMP法進(jìn)行檢測，確認(rèn)該方法的靈敏度。對于人為添加濃度為100CFU/mL致病菌的牛肉樣品，在增菌培養(yǎng)1、3、5、7 h后，用IMS-LAMP法進(jìn)行檢測。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用7500熒光定量PCR儀自帶的分析軟件對LAMP的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行擴(kuò)增曲線和循環(huán)閾（circulation threshold，Ct）

值的分析。若Ct值≤35，且擴(kuò)增曲線為“S”形曲線，則為陽性擴(kuò)增;若3538，則為陰性擴(kuò)增[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫磁珠投料比的確定

用不同體積的鼠傷寒沙門氏菌抗體和金黃色葡萄球菌多克隆抗體分別與1 mg的磁珠偶聯(lián)，制備不同投料比的免疫磁珠。由圖1可知，鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的捕獲率隨著抗體的增加而增加，鼠傷寒沙門氏菌的捕獲率在投料比為100∶1.0時達(dá)到最大，為52.60%，金黃色葡萄球菌的捕獲率在投料比為100∶0.6時達(dá)到最大，為50.87%。繼續(xù)增加抗體，2 種菌的捕獲率沒有明顯提高，甚至抗體加入過多，2 種菌的捕獲率有所降低，如投料比為100∶3.0時，鼠傷寒沙門氏菌的捕獲率為48.65%，金黃色葡萄球菌的捕獲率為48.78%。故后續(xù)實驗中，鼠傷寒沙門氏菌免疫磁珠選取100∶1.0為最佳投料比，金黃色葡萄球菌免疫磁珠選取100∶0.6為最佳投料比，即每毫克磁珠的鼠傷寒沙門氏菌抗體偶聯(lián)量為10 ?L，金黃色葡萄球菌抗體偶聯(lián)量為6 ?L。

2.2 免疫磁珠的最適添加量

由圖2可知：鼠傷寒沙門氏菌免疫磁珠添加量為50、100、200、300、400、500、600 ?L的捕獲率分別為18.77%、17.74%、35.99%、38.56%、51.93%、51.41%和49.36%，金黃色葡萄球菌免疫磁珠添加量為50、100、200、300、400、500、600 ?L的捕獲率分別為11.34%、15.07%、43.58%、54.33%、53.88%、53.28%和52.69%;隨著免疫磁珠添加量的增加，2 種菌的捕獲率逐漸升高，鼠傷寒沙門氏菌免疫磁珠添加量高于400 ?L，其捕獲率逐漸趨于平穩(wěn);金黃色葡萄球菌免疫磁珠添加量高于300 ?L，其捕獲率逐漸趨于平穩(wěn);繼續(xù)增加免疫磁珠，則會出現(xiàn)非特異性反應(yīng)，使免疫磁珠的捕獲率下降，影響實驗效果。故1 mL的反應(yīng)體系中，鼠傷寒沙門氏菌免疫磁珠的最適添加量為400 ?L，金黃色葡萄球菌免疫磁珠的最適添加量為300 ?L。

2.3 免疫磁珠與菌液的最佳反應(yīng)時間

由圖3可知：免疫磁珠與菌液孵育5 min和15 min時，鼠傷寒沙門氏菌的捕獲率為16.91%和26.26%，金黃色葡萄球菌的捕獲率為32.00%和48.40%，說明15 min內(nèi)，免疫磁珠未能與細(xì)菌充分結(jié)合;鼠傷寒沙門氏菌免疫磁珠的捕獲率在45 min達(dá)到最大值52.16%，金黃色葡萄球菌免疫磁珠的捕獲率在30 min達(dá)到最大值56.80%。但孵育時間過長不利于反應(yīng)的進(jìn)行，不僅會使富集到的細(xì)菌在長時間的孵育振蕩過程中脫落、降低捕獲率，也增加了實驗時間，不利于細(xì)菌的快速檢測。故鼠傷寒沙門氏菌免疫磁珠的最佳孵育時間為45 min，金黃色葡萄球菌免疫磁珠的最佳孵育時間為30 min。

2.4 IMS-LAMP方法的特異性

由圖4可知，對鼠傷寒沙門氏菌與6 株非鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，只有鼠傷寒沙門氏菌和陽性質(zhì)粒有明顯的擴(kuò)增曲線，而非鼠傷寒沙門氏菌與陰性對照沒有擴(kuò)增信號檢出，說明本方法對鼠傷寒沙門氏菌有較好的檢測特異性。

由圖5可知，對金黃色葡萄球菌與6 株非金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢測，只有金黃色葡萄球菌和其陽性質(zhì)粒有明顯的擴(kuò)增曲線，而非金黃色葡萄球菌與陰性對照沒有擴(kuò)增信號檢出，說明本方法對金黃色葡萄球菌有較好的檢測特異性。

2.5 人工污染牛肉中鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的檢測結(jié)果

對實際樣品進(jìn)行檢測，每個梯度進(jìn)行3 次平行檢測，若3 次全為陽性，則陽性率為100.00%，2 次為陽性，則陽性率為66.67%，1 次為33.33%。由表2可知，當(dāng)鼠傷寒沙門氏菌菌液濃度降至1.2×102 CFU/mL時，檢測陽性率從100.00%降為33.33%，該濃度下3 次檢測中只有1 次檢測到鼠傷寒沙門氏菌，后續(xù)濃度的陽性率為0%，說明該方法對牛肉中鼠傷寒沙門氏菌的檢測靈敏度為1.2×103 CFU/mL。對于鼠傷寒沙門氏菌菌液濃度1.2×100 CFU/mL的樣品，增菌5 h即可全部檢出。

由表3可知，當(dāng)金黃色葡萄球菌菌液濃度降至4.4×103 CFU/mL時，檢測陽性率從100.00%降為66.67%，該濃度下3 次檢測中有2 次檢測到金黃色葡萄球菌，后續(xù)濃度陽性率為0%，說明該方法對牛肉中金黃色葡萄球菌的檢測靈敏度為4.4×104 CFU/mL。對于金黃色葡萄球菌菌液濃度4.4×100 CFU/mL的樣品，增菌7 h即可全部檢出。

3 討 論

近年來，免疫磁珠技術(shù)在食品樣品目標(biāo)微生物的分離和濃縮過程中發(fā)揮了越來越重要的作用，這一過程比傳統(tǒng)的離心或過濾方法更有效[19]。傳統(tǒng)免疫磁珠將抗體固定到磁珠上，采用共價偶聯(lián)法，利用磁珠表面特殊的活化基團(tuán)，如羧基和氨基等，與抗體蛋白上的氨基或羧基基團(tuán)共價偶聯(lián)。該方法雖然簡單，但吸附抗體易受pH值、單分散性等微小條件變化的影響，且所用磁珠需要過夜活化和偶聯(lián)[20-21]。鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)具有良好的反應(yīng)特異性和較高的親和力，鏈霉親和素是一種四聚體蛋白，利用氫鍵和范德華力結(jié)合4 個生物素分子[22]。磁珠的粒徑是影響免疫磁珠捕獲性能的重要因素，諸多研究表明，納米磁珠比微米磁珠能更好地捕獲微生物[23-25]。本研究所用的500 nm鏈霉親和素磁珠能與生物素化的鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌抗體高效結(jié)合，把生物素化抗體緊密地固定在磁珠上。經(jīng)過體系優(yōu)化，對于1 mL的反應(yīng)體系，鼠傷寒沙門氏菌免疫磁珠的最佳投料比為100∶1.0，最適添加量為400 ?L，最佳孵育時間為45 min;金黃色葡萄球菌免疫磁珠的最佳投料比為100∶0.6，最適添加量為300 ?L，最佳孵育時間為30 min。

核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)可在等溫條件下對目標(biāo)核酸進(jìn)行檢測，相比傳統(tǒng)的PCR技術(shù)，不再需要昂貴的熱循環(huán)裝置，而LAMP技術(shù)就是一種高靈敏度的核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)，該方法額外利用2 條環(huán)引物，大大縮短了反應(yīng)時間[26-27]?，F(xiàn)在，利用LAMP反應(yīng)產(chǎn)物可與熒光染料結(jié)合的特點，在反應(yīng)體系中加入不同的熒光染料，可以實現(xiàn)對LAMP反應(yīng)的實時檢測，避免肉眼觀察誤差[28-30]。本研究將IMS技術(shù)與LAMP技術(shù)相結(jié)合建立鼠傷寒沙門氏菌與金黃色葡萄球菌IMS-LAMP檢測方法，方法特異性好，對于牛肉中鼠傷寒沙門氏菌的檢測靈敏度為

1.2×103 CFU/mL，增菌5 h后，檢測限可達(dá)1.2 CFU/mL。金黃色葡萄球菌的靈敏度為4.4×104 CFU/mL，增菌7 h后，檢測限可達(dá)4.4 CFU/mL。該方法利用IMS技術(shù)對2 種致病菌進(jìn)行濃縮吸附（<1 h），簡化樣品的處理過程，并用LAMP技術(shù)快速確認(rèn)（<45 min），可以在1 個工作日內(nèi)完成樣品分析。因而，本研究建立的IMS-LAMP方法可作為檢測鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的重要方法，對于被這2 種病菌污染的牛肉樣品，可在食用前進(jìn)行快速、簡單和低成本的檢測，降低食源性疾病發(fā)生的風(fēng)險，具有潛在的應(yīng)用價值。

參考文獻(xiàn)：

[1] 寇曉晶， 高峰， 謝春. 3 種食源性細(xì)菌免疫磁珠聯(lián)合ATP發(fā)光檢測技術(shù)研究[J]. 中國動物檢疫， 2019， 36（1）： 85-91. DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2019.01.021.

[2] ANDREA F， MARTINA C， BARTOLOMEO D V， et al. QCM-based immunosensor for rapid detection of Salmonella typhimurium in food[J]. Scientific Reports， 2018， 8（1）： 16137. DOI：10.1038/s41598-018-34285-y.

[3] TALAN D A， KRISHNADASAN A， GORWITZ R J， et al. Comparison of Staphylococcus aureus from skin and soft-tissue infections in US emergency department patients， 2004 and 2008[J]. Clinical Infectious Diseases， 2011， 53（2）： 144-149. DOI：10.1093/cid/cir308.

[4] 王程程. 基于免疫納米磁珠和量子點快速檢測金黃色葡萄球菌方法的研究[D]. 楊凌： 西北農(nóng)林科技大學(xué)， 2013： 7-11.

[5] KUMAR S， MITTAL G S. Rapid detection of microorganisms using image processing parameters and neural network[J]. Food and Bioprocess Technology， 2010， 3（5）： 741-751. DOI：10.1007/s11947-008-0122-6.

[6] MREMA N， MPUCHANE S， GASHE B A. Prevalence of Salmonella in raw minced meat， raw fresh sausages and raw burger patties from retail outlets in Gaborone， Botswana[J]. Food Control， 2006， 17（3）： 207-212. DOI：10.1016/j.foodcont.2004.09.019.

[7] HANNING I B， NUTT J D， RICKE S C. Salmonellosis outbreaks in the United States due to fresh produce： sources and potential intervention measures[J]. Foodborne Pathogens and Disease， 2009， 6（6）： 635-648. DOI：10.1089/fpd.2008.0232.

[8] 劉曉慧， 郭鳳柳， 賈月梅， 等. 金黃色葡萄球菌在蔬菜中生長狀況分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2015， 43（8）： 304-307. DOI：10.15889/j.issn.1002-1302.2015.08.101.

[9] 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會， 國家食品藥品監(jiān)督管理總局. 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗： GB 4789.4—2016[S]. 北京： 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2016.

[10] 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會， 國家食品藥品監(jiān)督管理總局. 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗： GB 4789.10—2016[S]. 北京： 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2016.

[11] EVERS E G. Predicted quantitative effect of logistic slaughter on microbial prevalence[J]. Preventive Veterinary Medicine， 2004， 65（1/2）： 31-46. DOI：10.1016/j.prevetmed.2004.06.008.

[12] 劉羽霏， 葉蕾， 孟赫誠， 等. 恒溫實時熒光法檢測金黃色葡萄球菌[J]. 現(xiàn)代食品科技， 2013， 29（9）： 2262-2266. DOI：10.13982/j.mfst.1673-9078.2013.09.012.

[13] 趙瑞雪， 杜美紅， 李靜雯， 等. 國產(chǎn)沙門氏菌免疫磁珠的制備及其

應(yīng)用[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報， 2018， 9（4）： 843-850. DOI：10.3969/j.issn.2095-0381.2018.04.027.

[14] 李倩茹， 胡霏， 楊悅熙， 等. 基于熒光微球的免疫層析法結(jié)合免疫磁珠分離技術(shù)快速定量檢測鼠傷寒沙門氏菌[J]. 現(xiàn)代食品科技， 2018， 34（3）： 196-202. DOI：10.13982/j.mfst.1673-9078.2018.03.029.

[15] NOTOMI T， OKAYAMA H， MASUBUCHI H， et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J]. Nucleic Acids Research， 2000， 28（12）： E63. DOI：10.1093/nar/28.12.e63.

[16] 殷宏， 湯小玉， 薛強(qiáng)， 等. 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增微流控檢測方法研究

進(jìn)展[J]. 檢驗檢疫學(xué)刊， 2018， 28（3）： 50-53.

[17] ZENG Jing， WEI Haiyan， ZHANG Lei， et al. Rapid detection of Vibrio parahaemolyticus in raw oysters using immunomagnetic separation combined with loop-mediated isothermal amplification[J]. InternationaL Journal of Food Microbiology， 2014， 174： 123-128. DOI：10.1016/j.ijfoodmicro.2014.01.004.

[18] 李亞茹， 周冬根， 夏杏洲， 等. 免疫磁珠分離-實時熒光PCR快速檢測蝦中沙門氏菌[J]. 現(xiàn)代食品科技， 2017， 33（11）： 235-242. DOI：10.13982/j.mfst.1673-9078.2017.11.034.

[19] RADISIC M， IYER R K， MURTHY S K. Micro and nanotechnology in cell separation[J]. International Journal of Nanomedicine， 2006， 1（1）： 3-14. DOI：10.2147/nano.2006.1.1.3.

[20] CAO Miao， LI Zhonghong， WANG Jianlong， et al. Food related applications of magnetic iron oxide nanoparticles： enzyme immobilization， protein purification， and food analysis[J]. Trends in Food Science and Technology， 2012， 27（1）： 47-56. DOI：10.1016/j.tifs.2012.04.003.

[21] 劉陽， 劉文俠， 孫力軍， 等. 基于NHS基團(tuán)修飾的副溶血性弧菌免疫磁珠制備及其富集性能評價[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2018， 46（6）： 1-4. DOI：10.13989/j.cnki.0517-6611.2018.06.001.

[22] SHAN Shan， ZHONG Zianlong， LAI Weihua， et al. Immunomagnetic nanobeads based on a streptavidin-biotin system for the highly efficient and specific separation of Listeria monocytogenes[J]. Food Control， 2014， 45： 138-142. DOI：10.1016/j.foodcont.2014.04.036.

[23] 山珊， 牛瑞江， 賴衛(wèi)華， 等. 免疫磁珠法富集沙門氏菌的優(yōu)化及應(yīng)用[J]. 食品工業(yè)科技， 2013， 34（13）： 153-156. DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2013.13.049.

[24] 鐘子清， 熊勇華， 賴衛(wèi)華， 等. 納米免疫磁珠富集單核增生李斯

特菌[J]. 食品科學(xué)， 2013， 34（23）： 212-215. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201323044.

[25] 姚驊珊， 朱志強(qiáng). 高效捕獲阪崎腸桿菌免疫磁珠的制備

研究[J]. 安徽化工， 2019， 45（1）： 55-59. DOI：10.3969/j.issn.1008-553X.2019.01.016.

[26] MARTZY R， KOLM C， KRSKA R， et al. Challenges and perspectives in the application of isothermal DNA amplification methods for food and water analysis[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry， 2019， 411（9）： 1695-1702. DOI：10.1007/s00216-018-1553-1.

[27] NAGAMINE K， HASE T， NOTOMI T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers[J]. Molecular and Cellular Probes， 2002， 16（3）： 223-229. DOI：10.1006/mcpr.2002.0415.

[28] SMITH C J， OSBORN A M. Advantages and limitations of quantitative PCR （Q-PCR） based approaches in microbial ecology[J]. Fems Microbiology Ecology， 2009， 67（1）： 6-20. DOI：10.1111/j.1574-6941.2008.00629.x.

[29] FANG Xueen， LIU Yingyi， KONG Jilie， et al. Loop-mediated isothermal amplification integrated on microfluidic chips for point-of-care quantitative detection of pathogens[J]. Analytical Chemistry， 2010， 82（7）： 3002-3006. DOI：10.1021/ac1000652.

[30] 賈雅菁， 付博宇， 王羽， 等. 實時熒光環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)檢測牛乳中的蠟樣芽孢桿菌[J]. 食品科學(xué)， 2016， 37（6）： 184-189. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201606033.