黃冠南 丁美月 馬金才

摘要：微生物作為土壤中的重要組成部分，對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)中的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)有著至關(guān)重要的作用。吉林四平地區(qū)是東北地區(qū)三大糧倉(cāng)之一，該地區(qū)粉黏壤土的微生物群落結(jié)構(gòu)情況雖然重要，卻鮮有人進(jìn)行研究。在該地區(qū)的農(nóng)業(yè)土地區(qū)域采集6個(gè)土壤樣品點(diǎn)，應(yīng)用二代高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行分析，并利用樣品中的優(yōu)勢(shì)類群與土壤理化性質(zhì)的Pearson相關(guān)性分析、典范對(duì)應(yīng)分析（CCA）以及方差分解分析（VPA），以確定該地區(qū)微生物群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的關(guān)系。分析結(jié)果顯示，共同影響細(xì)菌、真菌優(yōu)勢(shì)類群的環(huán)境因素是pH值和銨態(tài)氮含量。方差分解分析（VPA）結(jié)果則又進(jìn)一步指出，銨態(tài)氮含量、土壤pH值及土壤黏粒程度分別解釋了15.73%、22.84%、16.81%的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成變化原因;銨態(tài)氮含量、土壤pH值、溶解性有機(jī)碳含量分別解釋了24.32%、20.74%、22.37%的真菌群落結(jié)構(gòu)組成變化原因。通過(guò)二代高通量測(cè)序技術(shù)以及統(tǒng)計(jì)學(xué)研究，可以為東北地區(qū)粉黏壤土中的微生物群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的關(guān)系研究提供一些新的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：Illumina MiSeq高通量測(cè)序;粉黏壤土;細(xì)菌;真菌;優(yōu)勢(shì)類群

中圖分類號(hào)： X172 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）14-0306-04

土壤作為生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分之一，是人類與動(dòng)植物生存繁衍的基礎(chǔ)，也是土壤微生物的附著生境，并為其提供了較為豐富的食物。微生物在調(diào)節(jié)地球生物化學(xué)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的循環(huán)和生態(tài)系統(tǒng)功能等方面起著至關(guān)重要的作用[1-2]。由于近幾年來(lái)我國(guó)對(duì)于糧食產(chǎn)量的需求變大，東北農(nóng)作耕地作為我國(guó)重點(diǎn)保護(hù)的土壤生態(tài)資源，其墾殖面積不斷擴(kuò)增，濫用施肥的情況也日漸凸顯，使得黑土資源快速衰退的情況愈發(fā)惡化[3]。土壤微生物作為土壤結(jié)構(gòu)中極其重要的組成元素，也同時(shí)依賴于土壤的生態(tài)環(huán)境。近幾年來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)的日臻完善與成熟發(fā)展，為土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性的研究搭建了更為寬廣的平臺(tái)和途徑，使得人們對(duì)于土壤中細(xì)菌以及真菌的認(rèn)識(shí)愈加豐富[4]。

Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)[5]具有低成本、低錯(cuò)誤率、高通量等優(yōu)點(diǎn)，目前已經(jīng)成為分析自然界中細(xì)菌、真菌等微生物的群落結(jié)構(gòu)組成以及相對(duì)豐度的重要工具。由于目前東北四平地區(qū)農(nóng)耕地中的微生物群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性以及它們受到環(huán)境因子的影響情況鮮有人報(bào)道。本研究旨在探究吉林四平地區(qū)粉黏壤土[6]的微生物群落結(jié)構(gòu)及其與環(huán)境因子的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況與樣品采集

四平市是吉林省的第三大城市，也是東北地區(qū)的農(nóng)業(yè)重點(diǎn)區(qū)域，地處松遼平原中部腹地。四平市在地理上可劃分為平原、丘陵2種地帶，該地區(qū)的土地類型有著土地資源多樣化、地貌結(jié)構(gòu)復(fù)雜化、地域差異顯著化等特征[7]。

土壤樣品于2017年10月采集于吉林省四平地區(qū)的農(nóng)作耕地區(qū)域。采用五點(diǎn)取樣法采樣，將樣品置于冰袋中冷藏，并迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，于-80 ℃條件下保存，以便后續(xù)進(jìn)行土壤物理化學(xué)性質(zhì)的測(cè)定。土壤樣品的基本信息如表1所示。

1.2 土壤理化性質(zhì)的測(cè)定

土壤樣品經(jīng)過(guò)風(fēng)干以及過(guò)篩后，進(jìn)行以下理化性質(zhì)的分析：pH值，使用pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定;水溶性有機(jī)碳（簡(jiǎn)稱DOC）含量（mg/kg），使用總有機(jī)碳分析儀（SSM-5000A，日本）測(cè)定;總氮（簡(jiǎn)稱TN）含量（mg/kg），通過(guò)過(guò)硫酸鉀（K2S2O8）氧化分光光度法測(cè)定;銨態(tài)氮（簡(jiǎn)稱NH4+-N）含量（mg/kg）、硝態(tài)氮（簡(jiǎn)稱NO3--N）含量（mg/kg），分別使用納氏試劑分光光度法和雙波長(zhǎng)比色法測(cè)定;總?cè)芙庑粤祝ê?jiǎn)稱TDP）含量（mg/kg），采用鉬銻抗比色法測(cè)定;土壤質(zhì)地（黏粒、粉粒、沙粒含量，%），采用激光粒度分布儀（Bettersize 2000，丹東市百特儀器有限公司）測(cè)定。

1.3 總DNA的提取及16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增

土壤總DNA基因組的提取是采用DNA提取試劑盒進(jìn)行的。目標(biāo)片段的PCR擴(kuò)增通常以微生物核糖體RNA等能夠反映菌群組成和多樣性的目標(biāo)序列為靶點(diǎn)，根據(jù)序列中的保守區(qū)域設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，并添加樣本特異性條形碼序列，進(jìn)而對(duì)rRNA基因可變區(qū)（單個(gè)或連續(xù)多個(gè)）或特定基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增采用NEB公司的Q5高保真DNA聚合酶，并嚴(yán)格控制擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，使循環(huán)數(shù)盡可能低，同時(shí)也保證同一批樣本的擴(kuò)增條件一致。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用軟件Mothur進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并計(jì)算4種常用的生物多樣性指數(shù)。將優(yōu)勢(shì)菌門(mén)與土壤理化因子結(jié)合進(jìn)行Pearson相關(guān)分析。將細(xì)菌、真菌門(mén)水平上的分類信息用Origin軟件制圖以進(jìn)行展示，進(jìn)一步繪制優(yōu)勢(shì)菌門(mén)及其優(yōu)勢(shì)綱的相對(duì)豐度圖，細(xì)菌、真菌的分類信息用Origin 9.0制圖。用軟件R（Pheatmap）繪制CCA、VPA圖。使用SPSS 19.0（IBM，美國(guó)）開(kāi)展優(yōu)勢(shì)類群與土壤理化性質(zhì)的Pearson相關(guān)分析。應(yīng)用 R 3.3.2 調(diào)用vegan程序包進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

經(jīng)土壤質(zhì)地識(shí)別系統(tǒng)軟件（國(guó)際制標(biāo)準(zhǔn)）測(cè)定，吉林四平地區(qū)的土壤類型均為粉黏壤土。本研究采集的6個(gè)土壤樣品的基本理化性質(zhì)如表2所示。

2.2 微生物多樣性指數(shù)分析

微生物多樣性指數(shù)分析是研究土壤微生物多樣性的重要手段之一。對(duì)于常用的幾種多樣性指數(shù)，一般來(lái)說(shuō)，Chao1或ACE指數(shù)與群落的豐富度呈正相關(guān)，即Chao1或ACE指數(shù)越大，表明該群落的豐富度越高[8]。在本研究中采集到的土壤樣品的微生物多樣性指數(shù)如表3所示。其中細(xì)菌中SP5樣品的ACE指數(shù)高達(dá)3 049.55，Chao1指數(shù)高達(dá)2 906.50，說(shuō)明在SP5號(hào)樣品中的細(xì)菌群落豐富度最高。SP4號(hào)樣品真菌群落的Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)分別為553.01、553.58，均是同類中最高的，說(shuō)明SP4號(hào)樣品真菌群落的豐富度最高。細(xì)菌群落中的SP3、SP5，真菌群落中的SP2、SP3的群落豐富度、均勻度都相對(duì)較好。細(xì)菌和真菌群落SP2、SP6樣品的Chao1指數(shù)或ACE指數(shù)及Shannon指數(shù)都較低，說(shuō)明它們與其他樣品相比，群落豐富度和均勻度都是較低的。一般而言，Simpson指數(shù)對(duì)群落的均勻度以及優(yōu)勢(shì)OTU（最小操作分類單元）更為敏感，而Shannon指數(shù)則是對(duì)群落的豐富度及稀有OTU更為敏感[9]。

2.3 土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)組成與分析

將采集的土壤樣品進(jìn)行處理后，共獲得細(xì)菌25門(mén)97綱118目402科801屬和未確定類群。細(xì)菌優(yōu)勢(shì)門(mén)的相對(duì)豐度如圖1所示，可以看出，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)有放線菌門(mén)（Actinobacteria，相對(duì)豐度為32.95%）、變形菌門(mén)（Proteobacteria，相對(duì)豐度為29.73%），這二者在細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌門(mén)中占據(jù)主導(dǎo)地位，而其余優(yōu)勢(shì)菌門(mén)中，芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）的相對(duì)豐度為11.15%，酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）則為8.87%。

放線菌門(mén)亞綱水平上的相對(duì)豐度如圖2所示?？梢钥闯?，放線菌門(mén)下優(yōu)勢(shì)亞綱中放線菌亞綱（Actinobacteria）的相對(duì)豐度達(dá)到了58.43%，在放線菌門(mén)中的亞綱水平上占據(jù)主導(dǎo)地位，嗜熱油菌綱（Thermoleophilia）的相對(duì)豐度為 16.71%，醋酸菌亞綱（Acidimicrobiia）的相對(duì)豐度為12.26%，紅細(xì)菌亞綱（Rubrobacteria）的相對(duì)豐度為8.26%。其中放線菌亞綱（Actinobacteria）為最優(yōu)勢(shì)亞綱，其相對(duì)豐度也最高。

變形菌門(mén)亞綱水平上相對(duì)豐度如圖3所示?？梢悦黠@看出，α-變形菌綱（α-alphaproteobacteria）最具優(yōu)勢(shì)，相對(duì)豐度達(dá)到62.89%。而變形菌門(mén)亞綱水平上的其他亞綱排序依次為β-變形菌綱（β-betaproteobacteria）、δ-變形菌綱（δ-deltaproteobacteria）、γ-變形菌綱（γ-gammaproteobacteria），相對(duì)豐度分別為14.90%、12.28%、9.92%。

由圖4可見(jiàn)， 采集的土壤樣品經(jīng)處理后共獲得真菌7門(mén)31綱92目190科326屬和未確定類群。其中優(yōu)勢(shì)的真菌門(mén)有子囊菌門(mén)（Ascomycota），相對(duì)豐度為89.20%，在優(yōu)勢(shì)真菌門(mén)中占據(jù)主導(dǎo)地位。而擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）則占真菌總體的8.16%。

由于子囊菌門(mén)的相對(duì)豐度達(dá)到了89.20%，筆者對(duì)于其下 屬的優(yōu)勢(shì)亞綱進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中糞殼菌綱（Sordariomycetes）的相對(duì)豐度達(dá)到了51.32%，從圖5可以明顯看出。但是其余真菌優(yōu)勢(shì)門(mén)在采集的樣品中的比例體現(xiàn)得并不相對(duì)均勻，經(jīng)過(guò)分析統(tǒng)計(jì)得出，散囊菌綱（Eurotiomycetes）占13.40%，座囊菌綱（Dothideomycetes）占11.45%，未知菌綱占20.60%。

2.4 優(yōu)勢(shì)類群與土壤理化性質(zhì)的Pearson相關(guān)性分析

將細(xì)菌（相對(duì)豐度大于5%）和真菌（相對(duì)豐度大于1%）的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)與土壤中各項(xiàng)理化性質(zhì)作Pearson相關(guān)性分析。表4結(jié)果顯示，細(xì)菌群落中的酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）與 NH4+-N含量呈顯著負(fù)相關(guān)，芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）與pH值呈顯著負(fù)相關(guān)，其余的相關(guān)性均不顯著。而在真菌群落中，子囊菌門(mén)（Ascomycota）與NH4+-N含量呈顯著正相關(guān)，而擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）則與 NH4+-N 含量呈顯著負(fù)相關(guān)（表5）。

2.5 土壤理化性質(zhì)對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

對(duì)于微生物群落組成與環(huán)境因子之間的關(guān)系，筆者采用典范對(duì)應(yīng)分析（CCA）進(jìn)行研究[10]。其中主要環(huán)境因子包括pH值、TN含量、DOC含量、NH4+-N含量、NO-3-N含量和clay含量等。通過(guò)典范對(duì)應(yīng)分析，得到對(duì)細(xì)菌群落組成影響較大的因素分別有NH4+-N含量、pH值和clay含量（圖6），對(duì)真菌群落組成影響較大的因素則為DOC含量、pH值、NH4+-N含量（圖7）。

結(jié)合Pearson相關(guān)分析結(jié)果和細(xì)菌、真菌的CCA結(jié)果，選取這3個(gè)主要環(huán)境因素進(jìn)行方差分解分析（VPA），以進(jìn)一步量化主要環(huán)境因素對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)組成影響的具體貢獻(xiàn)。在細(xì)菌群落中，NH4+-N含量、pH值和黏粒含量這3個(gè)變量共解釋了72.57%的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化原因，其中 NH4+-N 含量、pH值和黏粒含量分別解釋了15.73%、22.84%、16.81%的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化原因。在真菌微生物群落中，DOC含量、NH4+-N含量和pH值這3個(gè)變量共解釋了79.26%的真菌群落結(jié)構(gòu)變化原因，DOC含量、pH值、NH4+-N 含量則分別解釋了22.37%、20.74%、24.32%的真菌群落結(jié)構(gòu)變化原因。

3 結(jié)論與討論

微生物組成與土壤理化性質(zhì)的Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，影響細(xì)菌各優(yōu)勢(shì)類群相對(duì)豐度的環(huán)境因素主要有NH4+-N含量、pH值和黏粒含量等，影響真菌各優(yōu)勢(shì)類群相對(duì)豐度的環(huán)境因素主要有DOC含量、pH值、NH4+-N含量。而反映微生物群落的總體水平受環(huán)境因素影響的CCA結(jié)果和Pearson相關(guān)性分析表明，NH4+-N含量、pH值是影響沙土中細(xì)菌、真菌群落結(jié)構(gòu)組成的共同環(huán)境因素。此外，細(xì)菌微生物群落結(jié)構(gòu)組成還受黏粒含量的影響，真菌微生物群落結(jié)構(gòu)組成還受DOC影響。

VPA結(jié)果又進(jìn)一步指出3個(gè)主要因素在細(xì)菌微生物群落、真菌微生物群落多樣性變化中的具體貢獻(xiàn)。其中pH值可能對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，也可能通過(guò)改變其他土壤理化性質(zhì)，包括陽(yáng)離子金屬溶解度、有機(jī)碳含量、土壤水分狀況和電導(dǎo)率等間接影響微生物群落結(jié)構(gòu)。但是，由于本研究中pH值的分布范圍較窄，所以得出的結(jié)果應(yīng)謹(jǐn)慎對(duì)待。

本研究應(yīng)用二代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)從吉林四平地區(qū)粉黏壤土采集的6個(gè)土壤樣品的微生物多樣性進(jìn)行了16S rRNA基因測(cè)序及整理，并運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行了分析[11-14]。本研究初步掌握了吉林四平地區(qū)粉黏壤土中細(xì)菌和真菌微生物群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性結(jié)構(gòu)及其受環(huán)境因子影響的情況以及與主要影響因子之間的關(guān)系，并進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)性分析，從而為該地區(qū)農(nóng)業(yè)耕地微生物群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的關(guān)系提供更為重要的依據(jù)。

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