陳曉峰 叢山 王百川

摘要：對(duì)灰霉菌（Botrytis cinerea）誘導(dǎo)抗、感大白菜葉片α-微管蛋白基因誘導(dǎo)表達(dá)的特點(diǎn)及微管動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行研究。結(jié)果表明，灰霉菌接種后大白菜中4種α-微管蛋白基因均具有上調(diào)表達(dá)特點(diǎn)，且抗病品種較感病品種誘導(dǎo)表達(dá)明顯。葉片細(xì)胞微管免疫熒光觀測(cè)發(fā)現(xiàn)，接種48、96 h后抗病品種較感病品種微管骨架受病原菌侵染影響較小，結(jié)構(gòu)變化不明顯。研究結(jié)果說明微管在植物對(duì)抗真菌病原菌侵染中具有一定的作用。

關(guān)鍵詞：大白菜;灰霉菌;葉片細(xì)胞;微管;α-微管蛋白;互作動(dòng)態(tài);結(jié)構(gòu)變化;作用機(jī)制

中圖分類號(hào)：S436.341 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）14-0124-03

微管是真核生物細(xì)胞的重要組成部分，它和微絲、中間纖維組成植物的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞形態(tài)發(fā)生、信號(hào)識(shí)別、細(xì)胞極性的建立等方面起著至關(guān)重要的作用[1-3]。在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中，微管蛋白還可以調(diào)節(jié)植物細(xì)胞以不同的形態(tài)來適應(yīng)環(huán)境和功能需求，同時(shí)對(duì)植物纖維素和木質(zhì)素合成，構(gòu)建完整細(xì)胞骨架均具有重要作用[4]。植物微管蛋白主要由α-微管蛋白和β-微管蛋白基因家族組成[4-8]，其貫穿整個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的全過程，參與微管的生長(zhǎng)發(fā)育和動(dòng)力學(xué)變化[9-12]。

最近幾年，關(guān)于微管骨架在植物抗性研究中的作用越來越受到重視，人們對(duì)微管骨架參與植物和病原菌互作中的作用進(jìn)行了廣泛研究[13-25]，發(fā)現(xiàn)通過化學(xué)物質(zhì)解聚細(xì)胞微管可阻礙過敏性壞死反應(yīng)（hypersensitive response，簡(jiǎn)稱HR）發(fā)生，加劇病原菌的入侵，降低植物抗病力[13，22-23]。在病原菌和外源化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)下，α-微管基因表達(dá)也不盡相同[2，14-17，23-25]，是否該基因家族全部成員都參與了植物抗性反應(yīng)目前尚不清楚。

本研究對(duì)不同抗性大白菜材料α-微管蛋白基因受病原菌誘導(dǎo)表達(dá)的特點(diǎn)進(jìn)行分析，對(duì)微管骨架在寄主與病原菌互作中的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行觀察，以期闡明微管在抗真菌病害體系中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2016—2018年在中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺(tái)研究院進(jìn)行。大白菜抗真菌病害品種為新煙雜3號(hào)（XYZ），感病品種為包頭蓮（BTL）。大白菜種子經(jīng)消毒后，于人工氣候箱在20～25 ℃、光周期12 h/d、相對(duì)濕度（85±5）%條件下培養(yǎng)，待幼苗長(zhǎng)至2～4張真葉時(shí)用于試驗(yàn)。

免疫熒光觀測(cè)所用果膠酶和纖維素酶，微管標(biāo)記抗體一抗為抗α-微管蛋白IgG，二抗為FITC結(jié)合的羊抗鼠IgG，均采用Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 灰霉菌接種液的制備和接種程序

灰霉菌（Botrytis cinerea）接種液的制備和接種參照馬清華等的方法[26-27]，最終配成的孢子懸浮接種液濃度為1×106個(gè)/mL。處理組每個(gè)單株葉片噴灑病原菌誘導(dǎo)液，對(duì)照組用純水代替病原菌誘導(dǎo)液。誘導(dǎo)處理后植株在100%相對(duì)濕度下保濕24 h，然后揭掉遮光物，于人工氣候箱在20～25 ℃、光周期12 h/d、相對(duì)濕度（85±5）%條件下培養(yǎng)，直至采樣結(jié)束，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)灰霉菌誘導(dǎo)α-微管蛋白基因表達(dá)

1.3.1 實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)引物設(shè)計(jì) 在GenBank大白菜數(shù)據(jù)庫中選取所需要的α-微管蛋白基因，引物設(shè)計(jì)參考Zhang等的研究[2]，大白菜actin基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)基因，用于實(shí)時(shí)定量PCR的反應(yīng)引物序列見表1。

1.3.2 實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序 采用Takara公司SYBR Premix Ex Taq試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。提取處理和對(duì)照葉片0、12、24、36、48、72、96 h的大白菜葉片RNA，利用反轉(zhuǎn)錄酶將mRNA合成cDNA。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參考陳曉峰等的方法[28]，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。

1.4 大白菜葉片細(xì)胞微管間接免疫熒光檢測(cè)

分別采集灰霉菌誘導(dǎo)接種0、48、96 h抗感病大白菜植株葉片，參考張靜宜等的方法[3]進(jìn)行微管免疫熒光觀測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 灰霉菌誘導(dǎo)α-微管蛋白基因表達(dá)分析

由圖1可知，4個(gè)α-微管蛋白基因均呈現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)特點(diǎn)，但表達(dá)特點(diǎn)各不相同。4個(gè)基因在抗病品種中的表達(dá)均高于感病品種，其中Bra006517和Bra002260基因呈現(xiàn)單峰表達(dá)特點(diǎn)，Bra014232基因在所有試驗(yàn)材料中呈現(xiàn)雙峰表達(dá)特點(diǎn)。4個(gè)α-微管蛋白基因均在誘導(dǎo)24～48 h內(nèi)出現(xiàn)峰值表達(dá)量，其中Bra014232基因表現(xiàn)出明顯的誘導(dǎo)表達(dá)特點(diǎn)，Bra002260、Bra006517、Bra039648呈現(xiàn)較弱的上調(diào)表達(dá)特點(diǎn)。感病品種中4個(gè)基因在誘導(dǎo)48 h后表達(dá)量明顯下降。

2.2 間接免疫熒光觀測(cè)大白菜葉片微管結(jié)構(gòu)差異

由圖2可知，灰霉菌誘導(dǎo)處理后，抗、感病品種葉片中微管顯微結(jié)構(gòu)觀測(cè)結(jié)果表現(xiàn)出明顯的差異，在整個(gè)誘導(dǎo)過程中，抗病品種XYZ的葉片細(xì)胞中細(xì)胞核周圍微管骨架結(jié)構(gòu)變化不明顯，部分細(xì)胞微管在病原菌誘導(dǎo)96 h后結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不完整現(xiàn)象。感病品種BTL葉片細(xì)胞在病原菌誘導(dǎo)48 h后微管骨架結(jié)構(gòu)出現(xiàn)分散現(xiàn)象，病原菌誘導(dǎo)96 h后，絕大部分微管結(jié)構(gòu)出現(xiàn)分散降解現(xiàn)象。

3 結(jié)論與討論

微管蛋白由于在保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞發(fā)育等過程中具有重要作用，人們對(duì)其在植物抗病體系中的作用進(jìn)行了廣泛研究。關(guān)于微管骨架與植物抗病性關(guān)系研究主要集中在病原菌與寄主過敏性壞死反應(yīng)和抗性化學(xué)物質(zhì)累積等方面[9]。研究發(fā)現(xiàn)，通過oryzalin等已知的誘導(dǎo)微管解聚的化學(xué)物質(zhì)處理植物材料，這些植物對(duì)外源病原菌侵染誘導(dǎo)過敏反應(yīng)細(xì)胞的產(chǎn)生率降低，抗性降低[9，16，23]。正常條件下植物微管呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)圍繞在細(xì)胞周圍，病原菌侵染植物組織后，免疫熒光觀測(cè)發(fā)現(xiàn)微管骨架分散聚集于侵染點(diǎn)或接種點(diǎn)周圍[14-18]，說明微管直接或者間接參與了植物的抗性反應(yīng)。

本研究對(duì)大白菜中4種α-微管蛋白基因進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)分析，這4個(gè)基因在大白菜不同組織中存在特異表達(dá)的特點(diǎn)，且受茉莉酸甲酯（MJ）、紫杉醇、赤霉素（GA3）等化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)[2]。本研究中筆者所在課題組發(fā)現(xiàn)4個(gè)α-微管蛋白基因均受灰霉菌誘導(dǎo)，呈上調(diào)表達(dá)特點(diǎn)，且抗病品種中微管蛋白基因表達(dá)量略高于感病品種，個(gè)別基因在抗病品種中出現(xiàn)雙峰表達(dá)特點(diǎn)，這都說明微管蛋白基因在抗病品種中參與了大白菜對(duì)真菌病原菌侵染的抗性反應(yīng)。對(duì)不同抗性材料葉片細(xì)胞中微管骨架的免疫熒動(dòng)態(tài)觀測(cè)發(fā)現(xiàn)，抗病品種葉片細(xì)胞中微管骨架結(jié)構(gòu)比較完整，只有少量細(xì)胞出現(xiàn)微管降解現(xiàn)象，而感病品種在誘導(dǎo)處理2 d后微管骨架結(jié)構(gòu)出現(xiàn)分散降解，微管降解導(dǎo)致植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化，說明微管骨架結(jié)構(gòu)完整對(duì)真菌病原菌與寄主抗性反應(yīng)的重要性。

未來須要著重研究整個(gè)微管基因家族組織和誘導(dǎo)表達(dá)特性，同時(shí)完善病原菌誘導(dǎo)植物細(xì)胞微管骨架的動(dòng)態(tài)研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]Chan J，Eder M，Crowell E F，et al. Microtubules and CESA tracks at the inner epidermal wall align independently of those on the outer wall of light-grown Arabidopsis hypocotyls[J]. Journal of Cell Science，2011，124（7）：1088-1094.

[2]Zhang Y W，Jin D，Xu C，et al. Regulation of bolting and identification of the α-tubulin gene family in Brassica rapa L. ssp pekinensis[J]. Genetics and Molecular Research，2016，15（1）：15017507.

[3]張靜宜，侯喜林，史公軍，等. 白菜組織細(xì)胞微管間接免疫熒光檢測(cè)體系的優(yōu)化[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2007，34（6）：1551-1554.

[4]饒國(guó)棟，張建國(guó). 植物微管蛋白基因研究進(jìn)展[J]. 世界林業(yè)研究，2013，26（3）：17-20.

[5]Kopczak S D，Haas N A，Hussey P J，et al. The small genome of Arabidopsis contains at least six expressed α-tubulin genes[J]. Plant Cell，1992，4（5）：539-547.

[6]Parrotta L，Cai G，Cresti M. Changes in the accumulation of α- and β-tubulin during bud development in Vitis vinifera L.[J]. Planta，2010，231（2）：277-291.

[7]Oakley R V，Wang Y S，Ramakrishna W，et al. Differential expansion and expression of α- and β-tubulin gene families in Populus[J]. Plant Physiology，2007，145（3）：961-973.

[8]Dixon D C，Seagull R W，Triplett B A. Changes in the accumulation of α- and β-tubulin isotypes during cotton fiber development[J]. Plant Physiology，1994，105（4）：1347-1353.

[9]Nogales E . A structural view of microtubule dynamics[J]. Cellular & Molecular Life Sciences Cmls，1999，56（1/2）：133-142.

[10]Nogales E，Wolf S G，Downing K H. Structure of the alpha-beta tubulin dimer by electron crystallography[J]. Nature，1998，391（6663）：199-203.

[11]Nogales E，Whittaker M，Milligan R A，et al. High-resolution model of the microtubule[J]. Cell，1999，96（1）：79-88.

[12]Carpenter J L，Ploense S E，Snustad D P，et al. Preferential expression of an α-tubulin gene of Arabidopsis in pollen[J]. Plant Cell，1992，4（5）：557-571.

[13]姚 晶，禹 坷，陳艷利，等. 微管骨架在辣椒-黃瓜炭疽病菌非寄主互作中的作用[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，2013，43（2）：136-142.

[14]Skalamera D，Heath M C. Changes in the cytoskeleton accompanying infection-induced nuclear movements and the hypersensitive response in plant cells invaded by rust fungi[J]. Plant Journal，1998，16（2）：191-200.

[15]Schmelzer E. Cell polarization，a crucial process in fungal defense[J]. Trends in Plant Science，2002，7（9）：411-415.

[16]Christopher-Kozjan R，Heath M C. Cytological and pharmacological evidence that biotrophic fungi trigger different cell death execution processes in host and non-host cells during the hypersensitive response[J]. Physiological and Molecular Plant Pathology，2003，62（5）：265-275.

[17]Hardham A R，Jones D A，Takemoto D. Cytoskeleton and cell wall function in penetration resistance[J]. Current Opinion in Plant Biology，2007，10（4）：342-348.

[18]Kobayashi I，Kobayashi Y，Yamaoka N，et al. Recognition of a pathogen and a nonpathogen by barley coleoptile cells. Ⅲ. Responses of microtubules and actin filaments in barley coleoptile cells to penetration attempts[J]. Canadian Journal of Botany，1992，70（9）：1815-1823.

[19]Takemoto D，Hardham A R. The cytoskeleton as a regulator and target of biotic interactions in plants[J]. Plant Physiology，2004，136（4）：3864-3876.

[20]Takemoto D，Jones D A，Hardham A R. GFP-tagging of cell components reveals the dynamics of subcellular reorganization in response to infection of Arabidopsis by oomycete pathogens[J]. Plant Journal，2003，33（4）：775-792.

[21]Münch S，Lingner U，F(xiàn)loss D S，et al. The hemi-biotrophic lifestyle of Colletotrichum species[J]. Journal of Plant Physiology，2008，165（1）：41-51.

[22]左 海，王海燕，馬 青. 微管骨架在小麥抗條銹菌侵染中作用的研究[C]. 中國(guó)植物病理學(xué)會(huì)2012年學(xué)術(shù)年會(huì). 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2012.

[23]郝心愿，李紅莉，禹 珂，等. 微絲骨架解聚劑在小麥-黃瓜白粉菌非寄主互作中的作用[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44（2）：291-298.

[24]Li H L，Wang H Y，Hao X Y，et al. Effects of microtubule polymerization inhibitor on the hypersensitive response of wheat induced by the non-host pathogen Sphaerotheca fuliginea[J]. Agricultural Sciences in China，2010，9（3）：378-382.

[25]Song X H，Ma Q，Hao X Y，et al. Roles of the actin cytoskeleton and an actin-binding protein in wheat resistance against Puccivia striiformis f. sp. tritici[J]. Protoplasma，2012，249（1）：99-106.

[26]馬清華，陳曉峰，牟晉華，等. 灰霉菌侵染大白菜后ADF7和ADF10基因表達(dá)分析[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，38（5）：742-747.

[27]王利英. 不結(jié)球白菜黑斑病抗性機(jī)制初步研究[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008：40.

[28]陳曉峰，隋好林，馬清華，等. 霜霉病菌誘導(dǎo)大白菜幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶基因的表達(dá)[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，47（2）：96-99.