陳 亮 余 佶 游湘淘 金旋鷺 丁家云 麻成金 姚茂君

(1. 吉首大學林產化工工程湖南省重點實驗室，湖南 張家界 427000；2. 吉首大學茶葉科學研究所，湖南 吉首 416000)

綠茶具有緩解動脈粥樣硬化、預防癌癥、抗炎抑菌、抗衰老等[1-4]功效，其抗氧化能力是體現(xiàn)其功效的重要指標[5]。目前，普遍認為的功效因子有茶多酚、氨基酸、黃酮等生物活性成分，可有效清除自由基，抑制活性氧的形成[6]，從而對涉及氧化應激的病理起作用。在綠茶沖泡過程中，抗氧化物質通過沖泡浸出而進入茶湯，從而起抗氧化作用，而抗氧化物質因組成、含量的不同，表現(xiàn)出的抗氧化性能也不同。Dra?enka等[7]發(fā)現(xiàn)綠茶中總酚類物質的浸出量與沖泡溫度呈正相關，且茶湯的抗氧化能力與總酚類物質的浸出量直接相關。Pérez-Burillo等[8]發(fā)現(xiàn)白茶多酚類物質的浸出量隨沖泡時間和水溫的增加而增加，茶湯清除自由基的能力呈線性增長，且在水溫98 ℃，沖泡時間7 min時，茶湯的感官品質及清除自由基的能力較好。以上研究主要集中在不同沖泡條件對茶湯中滋味成分浸出量、感官品質及抗氧化性能的影響，尚未見對綠茶(如黃金茶)中生物活性成分浸出規(guī)律及抗氧化性能的研究報道。

湘西黃金茶起源于湘西自治州保靖縣葫蘆鎮(zhèn)黃金村，是湖南省優(yōu)良的地方群體品種，也是湘西古老、特異、珍稀的地方茶樹品種資源[9]。湘西黃金茶以其高氨基酸含量(高達7.47%)[10]的特點，受國內外廣大茶葉愛好者的青睞。試驗擬以湘西黃金茶為研究對象，考察不同沖泡溫度、時間下茶多酚、游離氨基酸的浸出量，并建立浸出動力學模型；采用ABTS法、DPPH法測定茶湯體外抗氧化性能，并探討不同沖泡溫度、時間對其抗氧化性能的影響。旨在深入了解湘西黃金茶的營養(yǎng)價值，為湘西黃金茶深加工產品的開發(fā)提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

湘西黃金茶：湘西自治州保靖縣葫蘆鎮(zhèn)黃金村提供；

茶多酚標準品：江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司；

L-谷氨酸標準品：合肥博美生物科技有限責任公司；

1,1-二苯基-2-三硝基(DPPH)、2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)：阿拉丁試劑有限公司；

碳酸鈉、Folin-酚試劑、沒食子酸、無水乙醇、茚三酮等：分析純。

1.1.2 儀器與設備

紫外可見—分光光度計：UV-2450型，日本島津公司；

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：DF-101T型，上海力辰邦西儀器科技有限公司；

電子天平：FA224型，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；

數(shù)字恒溫水浴鍋：HH-2型，常州智博瑞儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 茶湯的制備 準確稱取黃金茶8 g，迅速加入到1 600 mL 蒸餾水中，水溫分別為60，70，80，90 ℃，以一定轉速攪拌并保持恒溫。分別在1，2，3，4，5，10，15，20，25，30，40，50，60 min 時用無菌注射器吸取一定量的茶湯，經0.45 μm有機微孔濾膜過濾，迅速放入4 ℃保存。

1.2.2 茶多酚含量的測定 采用何健等[11]方法并稍作修改。以沒食子酸為標準品，分別配置10，20，30，40，50 μg/mL 沒食子酸標準溶液，繪制標準曲線(y=3.761x+0.006 5，R2=0.997 5)。取1 mL茶湯樣品加入5.0 mL體積分數(shù) 10% Folin-酚試劑，搖勻，反應10 min，加入4.0 mL質量分數(shù)7.5%碳酸鈉溶液，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，于30 ℃水浴恒溫1 h，避光冷卻10 min，測定765 nm處吸光值，以沒食子酸當量GAE表示(mg GAE/mL)。

1.2.3 游離氨基酸含量的測定 采用Yin等[12]方法并稍作修改。以谷氨酸為標準品，分別配置40，60，80，100，120 μg/mL的谷氨酸標準溶液，繪制標準曲線(y=2.394 2x-0.097 9，R2=0.997 1)。吸取茶湯樣品1 mL，分別加入磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L，pH 8.0)，質量分數(shù) 2%茚三酮溶液0.5 mL，沸水浴15 min，冷卻至室溫，蒸餾水定容至25 mL，避光反應10 min，測定570 nm處吸光值，以谷氨酸當量GLU表示(mg GLU/mL)。

1.2.4 黃金茶中生物活性成分浸出動力學模型 茶湯中茶多酚、游離氨基酸等生物活性成分在沖泡過程中為典型的固-液相擴散傳質過程，滿足二階動力學方程[13]，如式(1)所示。

(1)

式中：

k——二階浸出速率常數(shù)，mL/(mg·min)；

CT——t時刻茶湯中生物活性成分的濃度，mg/mL；

C∞——茶湯中生物活性成分的飽和濃度，mg/mL。

將式(1)線性變換并積分，代入邊界條件t=0～t，Ct=0～C，得：

(2)

將式(2)線性變換得：

(3)

由式(3)可知，二階浸出速率常數(shù)k由t/C、Ct、C∞決定，以t/C—t作回歸直線圖，由該直線的斜率與截距可求得飽和濃度C∞和二階速率常數(shù)k。

根據(jù)Arrhenius方程可知，浸出速率常數(shù)k與溫度T間的關系如式(4)所示。

(4)

式中：

A——前因子， mL/(mg·min)；

R——摩爾氣體常量，8.314 5 J/(mol·K)；

T——熱力學溫度，K；

Ea——活化能，J/mol。

根據(jù)Arrhenius方程，以lnk—1/T作圖可得Ea與A。

1.2.5 DPPH清除率的測定 參考郭虹雯等[14]方法并稍作修改。取0.1 mL茶湯樣品與無水乙醇稀釋后的DPPH 溶液3.9 mL混合均勻，室溫靜置30 min，測定517 nm 處吸光值。繪制沒食子酸工作液標準曲線(y=1 070.8x+16.304，R2=0.992 2)，樣品的DPPH清除率用沒食子酸當量GAE表示(mg GAE/mL)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

各試驗處理均設3次重復。采用Excel 2016、SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，并用One-way ANOVA進行多重比較分析，利用Origin 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 沖泡條件對茶湯中茶多酚含量的影響

由圖1可知，同一沖泡時間下，茶多酚濃度隨沖泡溫度的升高逐漸增加，浸出速率也逐漸增大，0～1 min，60～90 ℃水溫下，茶多酚的浸出速率分別為0.029 3，0.035 2，0.059 2，0.084 7 mg GAE/(mL·min)；同一沖泡溫度下，黃金茶茶湯中茶多酚濃度與沖泡時間呈正相關，浸出速率與沖泡時間呈負相關。當水溫為90 ℃時，沖泡30 min后茶多酚濃度趨于穩(wěn)定，30～60 min內茶多酚濃度無明顯變化，約為0.330 1 mg GAE/mL。一般來說，沖泡水溫的升高、時間的延長，有利于茶多酚的浸出，但隨著水溫不斷升高、沖泡時間不斷延長，茶葉細胞破裂物質浸出的同時，茶多酚的氧化聚合反應也很劇烈，使茶多酚的浸出速率呈先增加后減小趨勢[16]。

圖1 沖泡溫度與時間對茶湯中茶多酚的影響

Figure 1 Effect of the brewing temperature and time on tea polyphenols from Xiangxi golden tea

方差分析結果(表1)顯示，沖泡時間與水溫對茶多酚浸出量的影響均極顯著(P<0.01)，依次為沖泡溫度>沖泡時間。

表1 茶多酚浸出量方差分析Table 1 Variance analysis of theamount of tea polyphenols

2.2 沖泡條件對茶湯中氨基酸含量的影響

由圖2可知，游離氨基酸的浸出趨勢與茶多酚類似。同一沖泡溫度下，一定時間內，茶湯中游離氨基酸濃度隨沖泡時間的延長而逐漸增加，浸出速率逐漸減小，沖泡水溫為90 ℃時，0～1 min游離氨基酸浸出速率達0.092 1 mg GLU/(mL·min)，4～5 min游離氨基酸浸出速率為0.021 8 mg GLU/(mL·min)，25～30 min游離氨基酸浸出速率為0.001 4 mg GLU/(mL·min)，30 min 后游離氨基酸濃度趨于穩(wěn)定，30～60 min游離氨基酸浸出速率僅為0.000 7 mg GLU/(mL·min)。同一沖泡時間下，游離氨基酸濃度隨沖泡溫度的升高而增大，且溫度越高，氨基酸浸出速率越大。60～90 ℃水溫沖泡，0～1 min游離氨基酸浸出速率分別為0.092 1，0.060 5，0.048 9，0.041 8 mg GLU/(mL·min)。根據(jù)相似相溶原理，游離氨基酸易溶于水，隨沖泡溫度的升高，分子運動越活躍，越有利于游離氨基酸與水形成氫鍵，促使游離氨基酸浸出。

圖2 沖泡溫度與時間對茶湯中氨基酸的影響Figure 2 Effect of the brewing temperature and time on amino acid from Xiangxi golden tea

方差分析結果(表2)顯示，沖泡溫度與時間對茶湯中游離氨基酸浸出量的影響均極顯著(P<0.01)，依次為沖泡時間>沖泡溫度。

表2 游離氨基酸浸出量方差分析Table 2 Variance analysis of the amount of free amino acid

2.3 茶湯中抗氧化物質浸出動力學模型

由圖3可知，不同沖泡溫度下，沖泡時間與茶多酚、游離氨基酸濃度的比值(t/Ct)隨沖泡時間(t)的增大基本呈直線上升趨勢。各擬合曲線的相關系數(shù)均>0.99，線性關系良好，說明黃金茶茶湯中茶多酚、游離氨基酸的浸出滿足二階動力學方程，具體動力學參數(shù)見表3。

圖3 不同沖泡溫度下茶湯生物活性成分濃度與沖泡時間的線性關系

Figure 3 Linearized plots of tea bioactive compounds concentrations on different brewing temperatures to time

表3 茶湯中生物活性成分浸出動力學參數(shù)Table 3 Kinetic parameters for the extraction of chemical constituents from tea infusion

由表3可知，茶湯中茶多酚、游離氨基酸的飽和濃度(C∞)、二階釋放速率常數(shù)(k值)隨沖泡溫度的升高而增大。升高溫度，生物活性成分溶解度增加，從而導致物質浸出率增大[17]。

2.4 沖泡條件對茶湯抗氧化性能的影響

由圖5可知，茶湯中DPPH、ABTS清除率在0～10 min 內隨沖泡時間的延長與水溫的增加而不斷增加，沖泡10 min時，茶湯中DPPH、ABTS清除率隨沖泡時間的延長緩慢增加并逐漸趨于穩(wěn)定，此時不同沖泡溫度(60，70，80，90 ℃)茶湯的DPPH清除率分別為0.037 9，0.054 8，0.061 2，0.067 1 mg GAE/mL，ABTS清除率分別為0.103 3，0.123 2，0.142 2，0.151 4 mg GAE/mL。

圖4 溫度與浸出速率常數(shù)的關系Figure 4 Relationship between temperature and the dissolution rate constant

圖5 沖泡溫度與時間對黃金茶茶湯抗氧化性能的影響Figure 5 Effects of brewing temperature and time on antioxidant properties of tea infusion

沖泡溫度的升高、時間的延長，使茶多酚濃度逐漸增加，浸出速率也逐漸增大，從而導致茶湯的抗氧化活性逐漸增大[19]。但水溫過高、沖泡時間過長，會出現(xiàn)多酚氧化現(xiàn)象，致使茶多酚浸出速率下降，對DPPH、ABTS清除速率下降。此外，茶湯的抗氧化能力還受VC、黃酮類化合物、游離氨基酸、茶多糖等生物活性成分的影響[20]。

3 結論

試驗探究了沖泡條件對湘西黃金茶茶多酚、游離氨基酸浸出規(guī)律及對其抗氧化性能的影響。結果表明，黃金茶茶湯中茶多酚、游離氨基酸濃度與沖泡時間及水溫均顯著相關(P<0.01)，茶湯DPPH、ABTS清除率隨沖泡溫度的增加而增加，30 min后趨于穩(wěn)定。沖泡黃金茶茶湯中茶多酚、游離氨基酸的浸出滿足二階動力學方程，且溫度與浸出速率常數(shù)k有良好的線性關系，游離氨基酸在茶湯中的浸出速率大于茶多酚。后續(xù)需進一步探討不同沖泡條件對生物活性成分的浸出規(guī)律與黃金茶感官品質、抗氧化能力之間的關系，闡明茶葉中生物活性成分的浸出規(guī)律，為黃金茶深加工產品開發(fā)、消費者科學飲茶提供理論參考。