董 昕

(品測(cè)〔上海〕檢測(cè)科技有限公司，上海 201108)

VE為脂溶性維生素，包含多種生育酚和生育三烯酚。根據(jù)苯環(huán)上甲基取代基數(shù)目和位置的不同，VE分為α-、β-、γ-、δ-生育酚和α-、β-、γ-、δ-生育三烯酚8種異構(gòu)體，具有抗腫瘤、防止動(dòng)脈硬化、改善心腦血管疾病、延緩衰老、增強(qiáng)免疫力等多種作用[1-2]。VE是人體必需的植物源維生素，人體自身無(wú)法合成，只能通過(guò)食物獲取。植物油中含有豐富的生育酚和生育三烯酚，是人類攝取VE的主要來(lái)源。不同VE異構(gòu)體的生物活性不同，其中α-型的生物活性最強(qiáng)，δ-型的抗氧化性最強(qiáng)。不同品種植物油中VE組成及含量不同，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值有很大差異。對(duì)植物油中VE各異構(gòu)體的含量測(cè)定，能為消費(fèi)者科學(xué)選購(gòu)植物油提供參考，也能在植物油品種鑒定、摻假鑒別上提供技術(shù)參考[3]。

食品中生育酚和生育三烯酚常用的檢測(cè)方法有分光光度法[4-5]、高效液相色譜法[6-7]、氣相色譜法[8-9]及傅里葉變換紅外光譜法[10]等。有關(guān)8種VE同分異構(gòu)體的同時(shí)快速反相液相色譜檢測(cè)技術(shù)較少，是一檢測(cè)難點(diǎn)。GB 5009.82—2016采用反相色譜法僅測(cè)定α-、β-、γ-、δ-生育酚4種VE；GB/T 26635—2011采用正相色譜法測(cè)定8種 VE同分異構(gòu)體，但是正相高效液相色譜法有許多缺點(diǎn)，如流動(dòng)相揮發(fā)性強(qiáng)、溶劑強(qiáng)致癌性、對(duì)儀器損耗大、重復(fù)性差、分析時(shí)間長(zhǎng)及穩(wěn)定性差等[11-12]。反相高效液相色譜一般采用甲醇、乙腈等毒性較小、揮發(fā)性弱的溶劑作流動(dòng)相，可以很好地克服正相色譜的不足。

試驗(yàn)擬采用常規(guī)的甲醇和水為流動(dòng)相，建立應(yīng)用PFP色譜柱對(duì)植物油中8種VE異構(gòu)體的超高效液相色譜分析方法。旨在更短的時(shí)間內(nèi)同時(shí)檢測(cè)植物油中8種維生素異構(gòu)體的含量，為植物油中VE異構(gòu)體便捷穩(wěn)定的檢測(cè)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑及耗材

1.1.1 主要儀器和設(shè)備

超高效液相色譜儀：Waters Acquity H Class 型，配熒光檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司；

純水儀：MILLI-Q型，美國(guó)Millipore公司；

分析天平：ME204型，瑞士梅特勒—托利多公司；

旋窩振蕩器：Talboys型，美國(guó)Talboys公司。

1.1.2 試劑及耗材

α-生育酚(99.6%)、β-生育酚(96.8%)、γ-生育酚(98.2%)、δ-生育酚(97.6%)、α-生育三烯酚(98.6%)、β-生育三烯酚(97.4%)、γ-生育三烯酚(97.9%)、δ-生育三烯酚(98.3%)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：德國(guó)Merk公司；

無(wú)水乙醇、異丙醇、丙酮、甲醇：色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

一次性注射器：5 mL，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；

尼龍濾膜：0.22 μm，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置及標(biāo)準(zhǔn)曲線

(1) 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別準(zhǔn)確稱取VE各異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)品50 mg(精確到0.1 mg)，用無(wú)水乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL棕色容量瓶中定容至刻度，得到VE各異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1 000 μg/mL)。于-20 ℃以下避光儲(chǔ)存，使用期限不超過(guò)3個(gè)月。標(biāo)準(zhǔn)溶液使用前需進(jìn)行標(biāo)定。

(2) 標(biāo)準(zhǔn)中間液：從各VE異構(gòu)體儲(chǔ)備液中取出10 mL 至100 mL棕色容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容至刻度，得到8種VE異構(gòu)體混合中間液(100 μg/mL)。

(3) 標(biāo)準(zhǔn)工作液：從8種VE異構(gòu)體混合中間液(100 μg/mL)中分別準(zhǔn)確吸取0.04，0.08，0.16，0.40，0.80，1.60，4.00 mL溶液至7個(gè)10 mL棕色容量瓶。用丙酮定容至刻度，得到濃度為0.4，0.8，1.6，4.0，8.0，16.0，40.0 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.2 色譜條件 色譜柱：PFP柱(4.6 mm×100 mm，2.7 μm)；流動(dòng)相：A為甲醇，B為水；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL；色譜柱溫度：30 ℃；洗脫程序：等度洗脫，甲醇∶水=93∶7(體積比)；激發(fā)波長(zhǎng)：295 nm；發(fā)射波長(zhǎng)：330 nm。

1.2.3 樣品處理 稱取1.000 g油樣，用10 mL丙酮溶解，渦旋混合器上充分混勻后，過(guò)0.22 μm尼龍濾膜后，上機(jī)待測(cè)(渦旋過(guò)程避免丙酮蒸發(fā)；整個(gè)過(guò)程中注意避光)。

1.3 含量計(jì)算

(1)

式中：

Xr——樣品中VE各異構(gòu)體含量，mg/kg；

m——樣品質(zhì)量，g；

V——樣品定容體積，mL；

Cr——測(cè)定用樣液中VE各異構(gòu)體的濃度，μg/mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取和凈化

GB 5009.82—2016是通過(guò)將油脂類樣品皂化處理，釋放出VE，通過(guò)有機(jī)溶劑萃取，濃縮，上液相色譜儀分析，處理過(guò)程較為麻煩，而且皂化過(guò)程中VE容易被氧化而損失掉，使測(cè)試結(jié)果不夠穩(wěn)定。研究將油脂樣品直接溶解于有機(jī)溶劑中，釋放出VE后直接上液相檢測(cè)。對(duì)于溶劑的選擇需滿足以下2個(gè)條件：① 脂溶性溶劑，使油脂能夠完全溶解；② 應(yīng)與后續(xù)的分析方法具有匹配性[1]?？扇芙庥蜆拥娜軇┯姓和椤⑹兔?、丙酮、異丙醇等溶劑，針對(duì)反相色譜中的后續(xù)流動(dòng)相，正已烷、石油醚等與流動(dòng)相不兼容，從而選擇直接用丙酮或異丙醇稀釋后上樣檢測(cè)。通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)丙酮溶解油脂效果優(yōu)于異丙醇且丙酮毒性相較于異丙醇更小，故選擇丙酮為提取溶劑。

2.2 色譜條件優(yōu)化

生育酚和生育三烯酚的β-和γ-異構(gòu)體結(jié)構(gòu)相似，疏水性質(zhì)差異不大，在以C18柱為固定相，乙腈—水、甲醇—乙腈、甲醇—水為流動(dòng)相時(shí)，β-和γ-生育酚及生育三烯酚異構(gòu)體相互重疊，不能有效分離。PFP色譜柱表面鍵合五氟苯基，有較強(qiáng)的幾何尺寸和立體形狀選擇性，能分離一些結(jié)構(gòu)相似、用烷基固定相很難分離的位置異構(gòu)體。故選擇PFP色譜柱作為分析柱。

VE在紫外檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器上均有響應(yīng)，而熒光檢測(cè)器的響應(yīng)靈敏度要優(yōu)于紫外檢測(cè)的，故選擇熒光檢測(cè)器檢測(cè)。

對(duì)于流動(dòng)相的選擇，研究前期嘗試了采用甲醇—水，甲醇—乙腈、乙腈—水、乙腈—二氯甲烷作做為流動(dòng)相；在以甲醇—乙腈、乙腈—水、乙腈—二氯甲烷等為流動(dòng)相時(shí)，α-生育三烯酚和δ-生育酚色譜峰重疊不能分開(kāi)，故選甲醇—水為流動(dòng)相。由于VE是脂溶性，因而流動(dòng)相中的甲醇比例應(yīng)盡量高，而甲醇比例太高時(shí)α-生育三烯酚和δ-生育酚兩個(gè)色譜峰也會(huì)有部分重疊；當(dāng)流動(dòng)相比例在甲醇∶水=93∶7(體積比)，流速為0.4 mL/min(超高效色譜柱比較適用的流速)時(shí)，8個(gè)VE同分異構(gòu)體能夠很好地分離(圖1)，且色譜峰型，分離效果均最佳，整個(gè)分析時(shí)間在12 min左右，大大縮短了VE的分析檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)靈敏度，由于無(wú)雜質(zhì)干擾，節(jié)省了溶劑的耗費(fèi)和檢測(cè)的時(shí)間及耗材成本。

圖1 8種VE異構(gòu)體液相色譜圖Figure 1 8 vitamin E isomerism body fluid chromatography

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和方法檢出限

8種VE異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配置成(0.4，0.8，1.6，4.0，8.0，16.0，40.0 μg/mL)進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以稱樣量1 g，定容體積10 mL，計(jì)算檢出限，線性方程及相關(guān)系數(shù)詳見(jiàn)表1。由表1可知：該方法各VE異構(gòu)體在0.4～40.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在0.999 174～0.999 870。

2.4 回收率和精密度

對(duì)大豆油樣品各VE異構(gòu)體分別添加3個(gè)濃度水平(4，8，20 mg/kg)，每個(gè)水平進(jìn)行6次試驗(yàn)，得到樣品中8種VE異構(gòu)體的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，詳見(jiàn)表2。由表2可知：各個(gè)濃度水平的添加回收率均在90%以上，精密度為0.28%～1.22%。

表1 8種VE異構(gòu)體的線性方程和相關(guān)系數(shù)Table 1 Linear equation and correlation coefficient for the 8 isomerans of vitamin E

表2 大豆油中8種VE異構(gòu)體樣品添加回收率和精密度Table 2 Recovery rate and precision of 8 vitamin E isomers in soybean oil samples

2.5 VE異構(gòu)體保留時(shí)間及分離度

各VE異構(gòu)體保留時(shí)間和相互之間分離度見(jiàn)表3、4。

表3 8種VE異構(gòu)體出峰順序、保留時(shí)間、基線寬度Table 3 Peak order, retention time, baseline width of 8 vitamin E isomers

表4 各異構(gòu)體之間分離度Table 4 Separability between isomers

由表3、4可知：8種VE異構(gòu)體能夠完全分離。

2.6 實(shí)測(cè)結(jié)果

從市面上隨機(jī)選取15種不同品種的植物油，采用本研究的檢測(cè)方法檢測(cè)其VE中的異構(gòu)體構(gòu)成，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 植物油中VE含量Table 5 Vitamin E content in vegetable oils mg/kg

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)植物油樣品檢測(cè)前處理的優(yōu)化，采用丙酮溶解樣品后上樣，在優(yōu)化的色譜條件下，PFP色譜柱超高效液相色譜法能很好地將8種VE異構(gòu)體分離開(kāi)，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，測(cè)試流程簡(jiǎn)單。相較于皂化法處理油樣，丙酮直接溶解提取法檢測(cè)VE損失更少，結(jié)果更準(zhǔn)確；相較于正相色譜分離，分析時(shí)間更短，重現(xiàn)性更好。采用該方法檢測(cè)了15種常用植物油中VE各異構(gòu)體的含量，滿足實(shí)際樣品分析的需求。