董 昕

(品測〔上?！硻z測科技有限公司，上海 201108)

VE為脂溶性維生素，包含多種生育酚和生育三烯酚。根據(jù)苯環(huán)上甲基取代基數(shù)目和位置的不同，VE分為α-、β-、γ-、δ-生育酚和α-、β-、γ-、δ-生育三烯酚8種異構(gòu)體，具有抗腫瘤、防止動脈硬化、改善心腦血管疾病、延緩衰老、增強免疫力等多種作用[1-2]。VE是人體必需的植物源維生素，人體自身無法合成，只能通過食物獲取。植物油中含有豐富的生育酚和生育三烯酚，是人類攝取VE的主要來源。不同VE異構(gòu)體的生物活性不同，其中α-型的生物活性最強，δ-型的抗氧化性最強。不同品種植物油中VE組成及含量不同，其營養(yǎng)價值有很大差異。對植物油中VE各異構(gòu)體的含量測定，能為消費者科學(xué)選購植物油提供參考，也能在植物油品種鑒定、摻假鑒別上提供技術(shù)參考[3]。

食品中生育酚和生育三烯酚常用的檢測方法有分光光度法[4-5]、高效液相色譜法[6-7]、氣相色譜法[8-9]及傅里葉變換紅外光譜法[10]等。有關(guān)8種VE同分異構(gòu)體的同時快速反相液相色譜檢測技術(shù)較少，是一檢測難點。GB 5009.82—2016采用反相色譜法僅測定α-、β-、γ-、δ-生育酚4種VE；GB/T 26635—2011采用正相色譜法測定8種 VE同分異構(gòu)體，但是正相高效液相色譜法有許多缺點，如流動相揮發(fā)性強、溶劑強致癌性、對儀器損耗大、重復(fù)性差、分析時間長及穩(wěn)定性差等[11-12]。反相高效液相色譜一般采用甲醇、乙腈等毒性較小、揮發(fā)性弱的溶劑作流動相，可以很好地克服正相色譜的不足。

試驗擬采用常規(guī)的甲醇和水為流動相，建立應(yīng)用PFP色譜柱對植物油中8種VE異構(gòu)體的超高效液相色譜分析方法。旨在更短的時間內(nèi)同時檢測植物油中8種維生素異構(gòu)體的含量，為植物油中VE異構(gòu)體便捷穩(wěn)定的檢測提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑及耗材

1.1.1 主要儀器和設(shè)備

超高效液相色譜儀：Waters Acquity H Class 型，配熒光檢測器，美國Waters公司；

純水儀：MILLI-Q型，美國Millipore公司；

分析天平：ME204型，瑞士梅特勒—托利多公司；

旋窩振蕩器：Talboys型，美國Talboys公司。

1.1.2 試劑及耗材

α-生育酚(99.6%)、β-生育酚(96.8%)、γ-生育酚(98.2%)、δ-生育酚(97.6%)、α-生育三烯酚(98.6%)、β-生育三烯酚(97.4%)、γ-生育三烯酚(97.9%)、δ-生育三烯酚(98.3%)標準物質(zhì)：德國Merk公司；

無水乙醇、異丙醇、丙酮、甲醇：色譜純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

一次性注射器：5 mL，上海安譜實驗科技股份有限公司；

尼龍濾膜：0.22 μm，上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液的配置及標準曲線

(1) 標準儲備液：分別準確稱取VE各異構(gòu)體標準品50 mg(精確到0.1 mg)，用無水乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL棕色容量瓶中定容至刻度，得到VE各異構(gòu)體標準儲備液(1 000 μg/mL)。于-20 ℃以下避光儲存，使用期限不超過3個月。標準溶液使用前需進行標定。

(2) 標準中間液：從各VE異構(gòu)體儲備液中取出10 mL 至100 mL棕色容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，得到8種VE異構(gòu)體混合中間液(100 μg/mL)。

(3) 標準工作液：從8種VE異構(gòu)體混合中間液(100 μg/mL)中分別準確吸取0.04，0.08，0.16，0.40，0.80，1.60，4.00 mL溶液至7個10 mL棕色容量瓶。用丙酮定容至刻度，得到濃度為0.4，0.8，1.6，4.0，8.0，16.0，40.0 μg/mL的系列標準工作液。

1.2.2 色譜條件 色譜柱：PFP柱(4.6 mm×100 mm，2.7 μm)；流動相：A為甲醇，B為水；流速：0.4 mL/min；進樣量：1 μL；色譜柱溫度：30 ℃；洗脫程序：等度洗脫，甲醇∶水=93∶7(體積比)；激發(fā)波長：295 nm；發(fā)射波長：330 nm。

1.2.3 樣品處理 稱取1.000 g油樣，用10 mL丙酮溶解，渦旋混合器上充分混勻后，過0.22 μm尼龍濾膜后，上機待測(渦旋過程避免丙酮蒸發(fā)；整個過程中注意避光)。

1.3 含量計算

(1)

式中：

Xr——樣品中VE各異構(gòu)體含量，mg/kg；

m——樣品質(zhì)量，g；

V——樣品定容體積，mL；

Cr——測定用樣液中VE各異構(gòu)體的濃度，μg/mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取和凈化

GB 5009.82—2016是通過將油脂類樣品皂化處理，釋放出VE，通過有機溶劑萃取，濃縮，上液相色譜儀分析，處理過程較為麻煩，而且皂化過程中VE容易被氧化而損失掉，使測試結(jié)果不夠穩(wěn)定。研究將油脂樣品直接溶解于有機溶劑中，釋放出VE后直接上液相檢測。對于溶劑的選擇需滿足以下2個條件：① 脂溶性溶劑，使油脂能夠完全溶解；② 應(yīng)與后續(xù)的分析方法具有匹配性[1]?？扇芙庥蜆拥娜軇┯姓和椤⑹兔?、丙酮、異丙醇等溶劑，針對反相色譜中的后續(xù)流動相，正已烷、石油醚等與流動相不兼容，從而選擇直接用丙酮或異丙醇稀釋后上樣檢測。通過試驗發(fā)現(xiàn)丙酮溶解油脂效果優(yōu)于異丙醇且丙酮毒性相較于異丙醇更小，故選擇丙酮為提取溶劑。

2.2 色譜條件優(yōu)化

生育酚和生育三烯酚的β-和γ-異構(gòu)體結(jié)構(gòu)相似，疏水性質(zhì)差異不大，在以C18柱為固定相，乙腈—水、甲醇—乙腈、甲醇—水為流動相時，β-和γ-生育酚及生育三烯酚異構(gòu)體相互重疊，不能有效分離。PFP色譜柱表面鍵合五氟苯基，有較強的幾何尺寸和立體形狀選擇性，能分離一些結(jié)構(gòu)相似、用烷基固定相很難分離的位置異構(gòu)體。故選擇PFP色譜柱作為分析柱。

VE在紫外檢測器和熒光檢測器上均有響應(yīng)，而熒光檢測器的響應(yīng)靈敏度要優(yōu)于紫外檢測的，故選擇熒光檢測器檢測。

對于流動相的選擇，研究前期嘗試了采用甲醇—水，甲醇—乙腈、乙腈—水、乙腈—二氯甲烷作做為流動相；在以甲醇—乙腈、乙腈—水、乙腈—二氯甲烷等為流動相時，α-生育三烯酚和δ-生育酚色譜峰重疊不能分開，故選甲醇—水為流動相。由于VE是脂溶性，因而流動相中的甲醇比例應(yīng)盡量高，而甲醇比例太高時α-生育三烯酚和δ-生育酚兩個色譜峰也會有部分重疊；當流動相比例在甲醇∶水=93∶7(體積比)，流速為0.4 mL/min(超高效色譜柱比較適用的流速)時，8個VE同分異構(gòu)體能夠很好地分離(圖1)，且色譜峰型，分離效果均最佳，整個分析時間在12 min左右，大大縮短了VE的分析檢測時間，提高了檢測靈敏度，由于無雜質(zhì)干擾，節(jié)省了溶劑的耗費和檢測的時間及耗材成本。

圖1 8種VE異構(gòu)體液相色譜圖Figure 1 8 vitamin E isomerism body fluid chromatography

2.3 標準曲線和方法檢出限

8種VE異構(gòu)體標準物質(zhì)配置成(0.4，0.8，1.6，4.0，8.0，16.0，40.0 μg/mL)進樣，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。以稱樣量1 g，定容體積10 mL，計算檢出限，線性方程及相關(guān)系數(shù)詳見表1。由表1可知：該方法各VE異構(gòu)體在0.4～40.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在0.999 174～0.999 870。

2.4 回收率和精密度

對大豆油樣品各VE異構(gòu)體分別添加3個濃度水平(4，8，20 mg/kg)，每個水平進行6次試驗，得到樣品中8種VE異構(gòu)體的回收率及相對標準偏差，詳見表2。由表2可知：各個濃度水平的添加回收率均在90%以上，精密度為0.28%～1.22%。

表1 8種VE異構(gòu)體的線性方程和相關(guān)系數(shù)Table 1 Linear equation and correlation coefficient for the 8 isomerans of vitamin E

表2 大豆油中8種VE異構(gòu)體樣品添加回收率和精密度Table 2 Recovery rate and precision of 8 vitamin E isomers in soybean oil samples

2.5 VE異構(gòu)體保留時間及分離度

各VE異構(gòu)體保留時間和相互之間分離度見表3、4。

表3 8種VE異構(gòu)體出峰順序、保留時間、基線寬度Table 3 Peak order, retention time, baseline width of 8 vitamin E isomers

表4 各異構(gòu)體之間分離度Table 4 Separability between isomers

由表3、4可知：8種VE異構(gòu)體能夠完全分離。

2.6 實測結(jié)果

從市面上隨機選取15種不同品種的植物油，采用本研究的檢測方法檢測其VE中的異構(gòu)體構(gòu)成，檢測結(jié)果見表5。

表5 植物油中VE含量Table 5 Vitamin E content in vegetable oils mg/kg

3 結(jié)論

通過對植物油樣品檢測前處理的優(yōu)化，采用丙酮溶解樣品后上樣，在優(yōu)化的色譜條件下，PFP色譜柱超高效液相色譜法能很好地將8種VE異構(gòu)體分離開，測定結(jié)果準確，測試流程簡單。相較于皂化法處理油樣，丙酮直接溶解提取法檢測VE損失更少，結(jié)果更準確；相較于正相色譜分離，分析時間更短，重現(xiàn)性更好。采用該方法檢測了15種常用植物油中VE各異構(gòu)體的含量，滿足實際樣品分析的需求。