趙梓月 王思遠 廖森泰 穆利霞 鄒宇曉

(1. 廣東省農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東 廣州 510610；2. 廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東 廣州 510610；3. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點實驗室，廣東 廣州 510610)

目前市場上的補鈣產(chǎn)品大多為碳酸鈣、葡萄糖酸鈣和乳酸鈣等離子鈣，這些離子鈣溶解性較差，吸收時需消耗大量胃酸，吸收率和生物利用率低，在腸道中易形成鈣沉淀[1]。氨基酸及多肽能與鈣離子形成可溶性螯合物，完整地被轉(zhuǎn)運吸收，螯合鈣作為第三代補鈣制劑，具有穩(wěn)定性好、生物利用率高、抗干擾性強的優(yōu)點，如酪蛋白磷酸肽，是目前為止發(fā)現(xiàn)的最具促鈣吸收作用的短肽，作為鈣強化劑被廣泛應用于嬰幼兒食品及其他補鈣類功能食品當中，此外市場上還有卵黃高磷蛋白磷酸肽螯合鈣和復方氨基酸螯合鈣等，但產(chǎn)品種類還較單一，價格較高。近年來，國內(nèi)外學者已從多種食品蛋白中制備出金屬螯合肽，如大豆[2]、南極磷蝦[3]、太平洋鱈魚[4]等，并發(fā)現(xiàn)這些肽類在改善鈣等二價礦物元素生物利用度方面具有極大的潛力，同時有研究[2]表明肽鈣結(jié)合能力與多肽中羧基含量呈線性相關(guān)，其結(jié)合位點可能是Glu、Asp上的羧基。因此，尋找高效、低成本的多肽材料來開發(fā)多肽螯合鈣制劑具有十分重要的意義。同時，目前關(guān)于肽鈣結(jié)合機制的研究主要集中在磷酸基團—鈣、羧基—鈣兩種模式[5]，也有研究[6]發(fā)現(xiàn)還有其他多種基團在肽鈣反應中發(fā)生了變化，但上述研究均未涉及多肽中活性基團與鈣結(jié)合的先后順序，還有待進一步深入探討。

中國種桑養(yǎng)蠶歷史悠久，傳統(tǒng)養(yǎng)蠶業(yè)以繭絲為主產(chǎn)品，蠶蛹作為副產(chǎn)物產(chǎn)量很大。據(jù)統(tǒng)計，中國每年可產(chǎn)鮮繭60余萬t，蠶蛹產(chǎn)量可達40余萬t[7]，繅絲后的蠶蛹大多廢棄或加工為飼料，利用率和經(jīng)濟效益較低。蠶蛹中蛋白質(zhì)含量約為12%～16%，具有良好的氨基酸配比，且Asp和Glu含量最高，分別可達總氨基酸的10%和14%左右[8]，可提供豐富的肽—鈣結(jié)合位點，是制備肽螯合鈣的優(yōu)質(zhì)原料,但目前尚無蠶蛹多肽螯合鈣的相關(guān)研究報道。筆者[9]前期建立了蠶蛹多肽制備工藝，并發(fā)現(xiàn)其具有良好的與鈣結(jié)合能力。試驗以蠶蛹為原料制備肽螯合鈣，利用響應面優(yōu)化法確定其最佳工藝條件，并跟蹤螯合反應中多肽隨鈣源添加的結(jié)構(gòu)變化規(guī)律，探索鈣與多肽的結(jié)合機理，以期挖掘出一種高含鈣量的多肽螯合鈣原料，為新型高效的補鈣制劑研制和蠶桑資源綜合開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

新鮮削絲蠶蛹：兩廣2號，韶關(guān)翁源縣真誠意蠶桑專業(yè)合作社；

Alcalase酶(4.3×106U/mg)、胃蛋白酶(3.0×105U/mg)、胰蛋白酶(4.3×106U/mg)、復合蛋白酶(2.3×106U/mg)：諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司；

石油醚、硫化鈉、檸檬酸鈉、氫氧化鉀、氯化鈣、無水乙醇、鹽酸：分析純，天津市大茂化學試劑廠；

氫氧化鈉、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)：分析純，福晨(天津)化學試劑有限公司；

絡黑T：分析純，天津市天新精細化工開發(fā)中心。

1.1.2 主要儀器設備

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：DF-101S型，鞏義市予華儀器有限責任公司；

高速冷凍離心機：CR22G Ⅲ型，廣東廣州日立工機有限公司；

電熱恒溫鼓風干燥箱：DHG-9245A型，上海一恒科學儀器有限公司；

真空冷凍干燥機：ST85Best型，美國Millrock公司；

紫外分光光度計：UV-1800型，日本島津公司；

傅立葉紅外光譜測定儀：VERTEX 70型，德國Bruker公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 蠶蛹多肽螯合鈣的制備

蠶蛹→漂燙(2 min)→烘干(60 ℃)→粉碎、過篩(40目)→石油醚脫脂(3倍體積的石油醚浸泡蠶蛹粉，于常溫振蕩4 h，抽濾除去溶劑，重復3次)→酶解(調(diào)配質(zhì)量分數(shù)20%的蠶蛹粉溶液，加入質(zhì)量分數(shù)0.2%的Alcalase酶，55 ℃酶解4 h)→滅酶(沸水浴5 min)→離心(4 000 r/min離心15 min)取上清液→鈣螯合→醇沉(加入4倍體積95%乙醇進行沉淀)→離心(4 000 r/min離心15 min)取沉淀→冷凍干燥→蠶蛹多肽螯合鈣

1.2.2 蠶蛹多肽螯合鈣含量、得率及螯合率的測定

(1) 鈣含量測定：參照GB/T 5009.92—2016中的EDTA滴定法。

(2) 蠶蛹多肽螯合鈣得率：按式(1)計算。

(1)

式中：

Y——得率，%；

m1——蠶蛹多肽螯合鈣質(zhì)量，g；

m2——蠶蛹多肽質(zhì)量，g;

m3——氯化鈣質(zhì)量，g。

(3) 蠶蛹多肽螯合鈣螯合率：按式(2)計算。

(2)

式中：

C——螯合率，%；

m1——螯合態(tài)鈣元素含量，g；

m2——反應體系中鈣元素含量，g。

1.2.3 單因素試驗設計

(1) 蛋白酶的影響：選取4種蛋白酶(Alcalase酶、胰蛋白酶、復合蛋白酶、胃蛋白酶)對蠶蛹蛋白進行酶解，酶解后的蠶蛹多肽在pH 8、反應溫度60 ℃、反應時間60 min、肽鈣質(zhì)量比1∶1的條件下進行反應，以鈣含量為主要指標確定出最佳蛋白酶。

(2) pH的影響：選取Alcalase酶酶解蠶蛹蛋白，在反應溫度60 ℃、反應時間60 min、肽鈣質(zhì)量比1∶1條件下，分別選取pH 4，6，8，10，12進行反應，以鈣含量為主要指標確定出最佳pH。

(3) 反應溫度的影響：選取Alcalase酶酶解蠶蛹蛋白，在pH 10、反應時間60 min、肽鈣質(zhì)量比1∶1條件下，分別選取反應溫度30，45，60，75，90 ℃進行反應，以鈣含量為主要指標確定出最佳反應溫度。

(4) 反應時間的影響：選取Alcalase酶酶解蠶蛹蛋白，在pH 10、反應溫度75 ℃、肽鈣質(zhì)量比1∶1條件下，分別選取反應時間20，40，60，80，100 min進行反應，以鈣含量為主要指標確定出最佳反應時間。

(5) 肽鈣質(zhì)量比的影響：選取Alcalase酶酶解蠶蛹蛋白，在pH 10、反應溫度75 ℃、反應時間80 min條件下，分別選取肽鈣質(zhì)量比10∶1，4∶1，2∶1，1∶1，1∶2進行反應，以鈣含量為主要指標確定出最佳肽鈣質(zhì)量比。

1.2.4 響應面試驗分析 在單因素試驗確定的適宜反應條件基礎(chǔ)上，按照 Box-Behnken 中心組合設計原理進一步優(yōu)化反應條件。

1.2.5 蠶蛹多肽螯合鈣紫外光譜分析 配制濃度為 2 mg/mL的蠶蛹多肽和蠶蛹多肽螯合鈣樣品，在200～400 nm的波長范圍內(nèi)進行紫外掃描。

1.2.6 蠶蛹多肽螯合鈣紅外光譜分析 分別取蠶蛹多肽和肽鈣質(zhì)量比為30∶1，20∶1，10∶1，5∶1的蠶蛹多肽螯合鈣1 mg與100 mg干燥的 KBr 混合、研磨、壓片，在 4 000～400 cm-1的范圍內(nèi)利用傅里葉紅外光譜儀掃描出紅外光譜圖。

1.2.7 蠶蛹多肽螯合鈣掃描電鏡分析 取一定量蠶蛹多肽短肽、蠶蛹多肽螯合鈣凍干粉樣品抖落至樣盤雙面膠上，經(jīng)噴金鍍膜處理后放入掃描電鏡抽真空，施加一定電壓后，在1 000倍數(shù)下獲取掃描圖像。電鏡掃描條件設定為高壓5.00 kV；束流6.9×10-2mA；工作距離8.5 mm。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 試驗應用 Design-expert V8.0.6 軟件進行響應面設計，應用Origin 9.0軟件進行紫外光譜圖和紅外光譜圖繪制，采用 Excel 軟件繪制圖表，采用 SPSS 19.0 軟件進行單因素方差分析，所有試驗重復 3 次及以上，結(jié)果用(平均值±標準誤差)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 蛋白酶對蠶蛹多肽螯合鈣相關(guān)指標的影響 利用不同蛋白酶對蠶蛹蛋白進行酶解制備蠶蛹多肽，發(fā)現(xiàn)經(jīng)Alcalase酶酶解的蠶蛹多肽與鈣結(jié)合后制備出的多肽螯合鈣中鈣含量最高。這可能是由于不同蛋白酶的酶切位點不同導致，Adamson等[10]曾研究出Alcalase酶的酶切位點為Glu、Met、Leu、Tyr、Lys和Gln羧基側(cè)的肽鍵，使得多肽上的羧基暴露出來，提供較多的與鈣結(jié)合位點。

2.1.2 pH對蠶蛹多肽螯合鈣相關(guān)指標的影響 由圖2可得，蠶蛹多肽螯合鈣鈣含量受pH影響較大。當pH較低時，溶液中的H+含量較高，H+與Ca2+爭奪供電子基團-COO-，使多肽螯合鈣的量較少；當pH達到10時，OH-較多，使得-COOH的H+電離出來，有利于與鈣離子的結(jié)合；若pH繼續(xù)增大，過量的OH-會與Ca2+結(jié)合生成氫氧化鈣沉淀，從而使蠶蛹多肽螯合鈣量下降。因此，在響應面設計時，將pH因素的中心試驗點選在pH 10。

圖1 蛋白酶對鈣含量、螯合率、得率的影響Figure 1 Effect of protease on calcium content, yield and chelation rate

圖2 pH值對鈣含量、螯合率、得率的影響Figure 2 Effect of pH on calcium content, yield and chelation rate

2.1.3 反應溫度對蠶蛹多肽螯合鈣相關(guān)指標的影響 由圖3可以看出，反應溫度從30 ℃升高至90 ℃過程中，蠶蛹多肽螯合鈣的鈣含量呈現(xiàn)先上升后平穩(wěn)的趨勢，在75 ℃ 達到最大值。反應溫度越高，分子間運動越劇烈，使得分子間碰撞的幾率增大，有利于發(fā)生結(jié)合反應，當碰撞幾率達到一定程度，蠶蛹多肽與鈣結(jié)合反應達到最大。溫度繼續(xù)升高時，結(jié)合率反而下降，可能是高溫破壞了多肽分子的結(jié)構(gòu)，其構(gòu)象發(fā)生變化影響了與鈣的結(jié)合。因此，在響應面設計時將溫度因素的中心試驗點選在75 ℃。

2.1.4 反應時間對蠶蛹多肽螯合鈣相關(guān)指標的影響 由圖4可知，從反應20 min延長至反應100 min，蠶蛹肽螯合鈣中鈣含量變化較小，但在80 min時，螯合率和得率均達到最大值，因此選擇80 min作為蠶蛹肽螯合鈣的反應時間，響應面試驗中不再研究反應時間對蠶蛹多肽與鈣離子結(jié)合反應的影響。

圖3 溫度對鈣含量、螯合率、得率的影響Figure 3 Effect of temperature on calcium content,yield and chelation rate

圖4 反應時間對鈣含量、螯合率、得率的影響Figure 4 Effect of time on calcium content,yield and chelation rate

2.1.5 肽鈣質(zhì)量比對蠶蛹多肽螯合鈣相關(guān)指標的影響

由圖5可見，肽鈣質(zhì)量比對蠶蛹多肽螯合鈣中的鈣含量有較大影響，隨著肽鈣質(zhì)量比的增加，鈣含量呈先上升后下降的趨勢，在肽鈣質(zhì)量比為4∶1時鈣含量、得率達到最大值。若肽鈣質(zhì)量比過大，則氯化鈣添加不足，結(jié)合反應不完全，造成效率較低；若肽鈣質(zhì)量比過小，則氯化鈣添加過量，多肽上的鈣結(jié)合位點已飽和，造成鈣浪費。因此，在響應面設計時將肽鈣質(zhì)量比因素的中心試驗點選在4∶1。

圖5 肽鈣質(zhì)量比對鈣含量、螯合率、得率的影響Figure 5 Effect of peptide calcium ratio on calcium content, yield and chelation rate

2.2 響應面試驗設計結(jié)果及分析

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，按照Box-Behnken中心組合設計原理對蠶蛹多肽螯合鈣制備條件進一步優(yōu)化，以pH 10、溫度75 ℃、肽鈣質(zhì)量比4∶1為零點進行響應面設計。響應面編碼設計見表 1。

2.2.1 響應面試驗方案及結(jié)果 根據(jù)響應面設計確定響應面試驗方案如表2所示。選用 Box-Behnken 模型對pH、溫度、肽鈣質(zhì)量比3個因素結(jié)果進行多元線性回歸擬合，得到3個因素關(guān)于鈣含量的二次多項回歸方程模型為：

R=14.48+0.13A-1.14B-0.80C-1.33AB-1.36AC+1.15BC-3.67A2-3.36B2-2.12C2。

(3)

表1 中心組合實驗因素水平編碼表Table 1 Center combination of experimental factors level coding table

表2 響應面分析方案及試驗結(jié)果Table 2 Response surface analysis scheme and test results

在設定的因素水平內(nèi)對回歸方程進行數(shù)學運算，得出的反應最佳條件為pH 10.12、溫度72.57 ℃、肽鈣質(zhì)量比為3.41∶1，鈣含量最高理論值為14.740 5%。為方便試驗進行，調(diào)整反應條件為pH 10、溫度73 ℃、肽鈣質(zhì)量比3.4∶1，在此條件下進行3次實驗驗證，得到的蠶蛹多肽螯合鈣中平均鈣含量為14.51%，與預測值接近。

表3 響應面回歸模型方差分析Table 3 Responsesurface regression model variance analysis

圖6 響應面優(yōu)化圖Figure 6 Response surface optimization map

蠶蛹是蠶繭抽絲后剩下的主要副產(chǎn)物，本研究開發(fā)的蠶蛹多肽螯合鈣中鈣含量為14.51%，與已報道的多種肽螯合鈣如羊骨膠原多肽螯合鈣[11]、大豆肽螯合鈣[12]、豆粕多肽螯合鈣相比[13]，鈣含量顯著提高，具有較高的研究和生產(chǎn)價值。

2.3 紫外光譜分析

如圖7所示，通過蠶蛹多肽以及蠶蛹多肽螯合鈣進行紫外光譜掃描對比，發(fā)現(xiàn)蠶蛹多肽與鈣結(jié)合后，在280～300 nm的最大吸收峰值發(fā)生紅移，由288 nm移動至290 nm，且吸光度發(fā)生變化，表明有金屬螯合物生成，與多肽螯合物的相關(guān)報道[14-15]一致。

圖7 紫外光譜圖Figure 7 Ultraviolet spectrum

2.4 紅外光譜分析

蠶蛹多肽分子中含有羧基、羥基、氨基等基團，為進一步確定參與鈣結(jié)合的基團和先后順序，試驗研究了不同肽鈣比制備出的蠶蛹多肽螯合鈣的紅外光譜特征，如圖8所示，隨著鈣源的增加，蠶蛹肽螯合鈣紅外結(jié)構(gòu)有顯著差異。蠶蛹多肽與鈣反應后，在3 278.55，2 102.46，1 450.55，1 398.83，923.24 cm-15個吸收峰發(fā)生了明顯的變化。其中3 278.55 cm-1附近為N—H伸縮振動特征區(qū)，多肽螯合鈣變?yōu)? 379.73 cm-1，可能是由于NH2與Ca2+配位引起NH拉伸和氫鍵被取代，隨著鈣含量的提高，該峰強度不斷增強，說明氨基在不斷與Ca2+配位。2 102.46 cm-1是亞磷酸基團締結(jié)氫鍵形成的吸收峰，此峰在添加鈣量很小的情況下便消失，是由于蠶蛹多肽與鈣結(jié)合后亞磷酸基團締結(jié)的氫鍵被Ca2+取代[16]，推測亞磷酸基團優(yōu)先參與肽鈣反應。添加Ca2+后，對應于C═O 的波數(shù)從1 655.00 cm-1發(fā)生了藍移，隨著Ca2+的增加，當肽鈣質(zhì)量比達到5∶1時，在這附近生成一個新的吸收峰即1 598.80 cm-1處，主要是由于鈣含量增大使得羧酸與鈣反應生成羧酸鹽。在1 398.83 cm-1處觀察到的吸收峰發(fā)生了紅移，歸因于—COO—羧酸酯基團的延伸與Ca2+結(jié)合形成COOCa[17]。羧基中—OH的面內(nèi)振動吸收峰1 450.55 cm-1及面外振動吸收峰923.24 cm-1與鈣結(jié)合后消失，說明羧基中—OH參與肽鈣結(jié)合[18]。因此，氨基、羧基、磷酸基團參與了蠶蛹多肽與鈣的結(jié)合，其結(jié)合模式推測如圖9所示。

圖8 不同肽鈣比制備的蠶蛹多肽螯合鈣紅外光譜圖

Figure 8 Infrared spectrum of chelated calcium of silkworm pupapolypeptide prepared by different peptide to calcium ratio

圖9 肽鈣結(jié)合模式Figure 9 Peptide calcium binding mode

2.5 掃描電鏡分析

由圖10可看出，蠶蛹多肽表面光滑，結(jié)構(gòu)緊實；反應后，蠶蛹多肽螯合鈣表面變?yōu)槭杷啥嗫捉Y(jié)構(gòu)，有利于溶解吸收。

圖10 蠶蛹多肽與蠶蛹多肽螯合鈣掃描電鏡圖片

Figure 10 Silkworm pupa protein peptides and silkworm pupa protein peptides binding calcium SEM pictures

3 結(jié)論

以蠶蛹為原料制備了蠶蛹多肽螯合鈣，通過響應面優(yōu)化法確定了制備的最優(yōu)條件為pH 10、反應溫度73 ℃、肽鈣質(zhì)量比3.4∶1、反應時間80 min，在此條件下，得到的蠶蛹肽螯合鈣中鈣含量可達到14.51%，具有較高的研究和生產(chǎn)價值。通過紫外光譜、紅外光譜、掃描電鏡分析可知，蠶蛹多肽與鈣結(jié)合后結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，多肽中氨基、羧基、磷酸基團參與肽鈣結(jié)合反應。同時探究了多肽隨鈣源添加的結(jié)構(gòu)變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)磷酸基團極易參與肽鈣螯合反應。雖然蠶蛹本身具有產(chǎn)量大、氨基酸配比良好等優(yōu)勢，開發(fā)出的蠶蛹多肽螯合鈣鈣含量高，成本較低，但其生物利用率及安全性還有待通過細胞試驗和動物試驗進一步研究。