周夢琪，柴原，馮琬迪，馬浩潔，蓋聰，孫紅梅

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京102488)

帕金森病(PD)是一種發(fā)病率較高的神經(jīng)退行性疾病，與環(huán)境毒素和遺傳缺陷造成線粒體的異常及線粒體分裂融合的動態(tài)平衡被破壞密切相關(guān)[1,2]。線粒體的分裂主要由Drp1基因來調(diào)控，且分裂的頻率決定了線粒體的形態(tài)和功能。因此，Drp1基因與PD的關(guān)系越來越被關(guān)注和重視。2017年6月8日～2017年7月23日，本研究構(gòu)建了穩(wěn)定干擾Drp1基因的重組慢病毒載體質(zhì)粒Drp1-RNAi，包裝病毒后感染并篩選穩(wěn)定干擾Drp1基因的神經(jīng)母細胞瘤細胞株，為進一步研究Drp1基因在PD發(fā)病過程中的作用提供了細胞模型。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器 人神經(jīng)母細胞瘤細胞株SH-SY5Y、GV248慢病毒骨架質(zhì)粒hU6-MCS-CMV-EGFP、大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞、293T細胞、慢病毒包裝輔助質(zhì)粒pHelper 1.0載體和pHelper 2.0載體、嘌呤霉素(REVG1001)、聚凝胺(REVG0001)助感染試劑和Enhanced Infection Solution(REVG0002)感染用培養(yǎng)基均購自上海吉凱基因技術(shù)有限公司，T4 DNA連接酶和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo Scientific公司，限制性核酸內(nèi)切酶購自上海NEB公司，Taq Plus DNA polymerase購自南京Vazyme公司，Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑、TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司，無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，THUNDERBIRD qPCR定量檢測試劑購自日本TOYOBO公司，二氧化碳培養(yǎng)箱購自日本SANYO公司，高速冷凍離心機購自美國Thermo Scientific公司，倒置式熒光顯微鏡購自日本Nikon TE2000公司，超凈工作臺購自北京昌平長城空氣凈化工程公司，激光共聚焦掃描顯微鏡購自日本Olympus FV1000公司，Safire2全波長熒光酶標(biāo)儀購自瑞士TEcan公司，PCR儀購自美國ABI公司，測序儀購自美季生物公司，數(shù)顯式穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、凝膠成像儀購自天能公司，CytoFLEX流式細胞儀購自美國貝克曼庫爾特有限公司，細菌搖床購自華利達實驗設(shè)備公司，Blue Pard隔水式恒溫培養(yǎng)箱購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司，紫外分光光度儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 嘌呤霉素的細胞最低致死濃度篩選 取狀態(tài)良好且處于對數(shù)生長期的SH-SY5Y細胞接種于96孔板中培養(yǎng)24 h，設(shè)置實驗組、對照組。實驗組中分別加入1、2.5、5、7.5、10 μg/mL濃度的嘌呤霉素工作液，每個濃度設(shè)置5個復(fù)孔；對照組不加嘌呤霉素工作液。以不含SH-SY5Y細胞的孔為空白組，采用CCK-8法測算各組細胞存活率，結(jié)果顯示，隨著嘌呤霉素濃度增加，實驗組細胞存活率逐漸降低，但當(dāng)嘌呤霉素濃度為5、7.5、10 μg/mL時，實驗組細胞存活率均小于30%，且三組間細胞存活率相比，P均>0.05，故選取濃度最低的5 μg/mL為嘌呤霉素最低致死濃度進行后續(xù)實驗。

1.3 重組慢病毒載體質(zhì)粒Drp1-RNAi的構(gòu)建與鑒定 于Gen Bank中檢索人Drp1基因的核苷酸序列(基因編號10059 DNM1L)，利用BLOCK-iTTM RNAi Designer公用設(shè)計軟件(http://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/insert.do)設(shè)計并篩選最佳動力學(xué)參數(shù)的干擾序列為：5′-GTGGTGCTAGAATTTGTTA-3′，同時設(shè)計作為陰性對照的無關(guān)序列為：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′，根據(jù)靶序列分別設(shè)計并合成干擾RNA(siRNA)的單鏈DNA寡核苷酸(DNA oligo)。把合成的單鏈DNA oligo干粉與退火緩沖液配制成終濃度為20 μmol/L 的溶液，90 ℃水浴15 min，自然冷卻至室溫，退火后形成帶黏性末端的雙鏈DNA oligo片段。分別用AgeⅠ與EcoRⅠ雙酶切雙鏈DNA oligo片段和GV248慢病毒骨架質(zhì)粒hU6-MCS-CMV-EGFP后，加入T4 DNA連接酶4 ℃連接過夜，得到重組慢病毒載體質(zhì)粒Drp1-RNAi和陰性對照質(zhì)粒。將10 μL重組慢病毒載體質(zhì)粒Drp1-RNAi加入到100 μL大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞中,冰上反應(yīng)30 min，42 ℃熱激90 s，冰水培養(yǎng)2 min。取適量菌液均勻涂布在含有氨芐霉素的平板上，在恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12～16 h，挑選單個菌落分別接種于LB液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃搖床上振蕩培養(yǎng)16 h，按照無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒說明書分別提取質(zhì)粒DNA，用測序儀對其進行DNA測序，將DNA測序結(jié)果與設(shè)計的干擾序列進行對比，進一步確定插入序列的正確性。

1.4 穩(wěn)定干擾Drp1基因的神經(jīng)母細胞瘤細胞株的建立及鑒定 取對數(shù)生長期293T細胞于細胞培養(yǎng)皿中重懸，待細胞匯合度70%～80%時，用Lipofectamine 3000將重組慢病毒載體質(zhì)粒Drp1-RNAi和輔助質(zhì)粒(pHelper 1.0載體和pHelper 2.0載體)轉(zhuǎn)染至293T細胞中，培養(yǎng)48 h后收集上清液，離心后過濾得到Drp1-RNAi重組慢病毒和陰性對照慢病毒，分裝后儲存于-80 ℃冰箱內(nèi)備用。取對數(shù)生長期SH-SY5Y細胞，以5×104/mL接種于6孔板中，分為Drp1-RNAi重組慢病毒組(D組)、陰性對照組(N組)、正常對照組(C組)。D組、N組分別加入Drp1-RNAi重組慢病毒、陰性對照慢病毒和含10 μg聚凝胺助感染試劑的細胞增強液，培養(yǎng)24 h后更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，再用含5 μg/mL嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基進行篩選，每隔2～3 d換液、傳代，反復(fù)篩選2周，熒光顯微鏡下觀察，帶有綠色熒光的細胞即為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株。C組細胞使用普通培養(yǎng)基正常培養(yǎng)。①采用實時熒光定量PCR法檢測各組細胞Drp1 mRNA。收集各組細胞，采用TRIzol法提取各組細胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以β-actin為內(nèi)參，進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。引物序列如下:Drp1上游引物為5′-GGTGAAGCGGCAAATCAAACG-3′，下游引物為5′-ATGTTTTGTGTTGATATAAGCCA-3′；β-actin上游引物為5′-CGGCTACAGCTTCACCACCA-3′，下游引物為5′-CGGGCAGCTCGTAGCTCTTC-3′。建立20 μL PCR反應(yīng)體系:cDNA 2 μL、power 10 μL、H2O27.2 μL、上下游引物各0.4 μL。PCR反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性10 min，40 個循環(huán)(95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s、95 ℃ 15 s)。以2-ΔΔCt表示Drp1 mRNA的相對表達量。②采用Western blotting法檢測各組細胞Drp1蛋白。收集各組細胞，使用RIPA裂解液提取各組細胞總蛋白，用BCA試劑盒進行蛋白濃度測定后進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后封閉1 h，加入相應(yīng)的一抗，常溫在搖床上孵育1 h后4 ℃過夜，次日用TBST洗膜3遍，每次15 min，隨后加入相應(yīng)的二抗孵育1 h，加入ECL化學(xué)發(fā)光液后采用凝膠成像系統(tǒng)顯像，使用Image J軟件分析條帶灰度值，計算Drp1蛋白的相對表達量。Drp1蛋白的相對表達量=Drp1蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 重組慢病毒載體質(zhì)粒Drp1-RNAi的鑒定結(jié)果 DNA測序結(jié)果顯示，重組慢病毒載體質(zhì)粒Drp1-RNAi的DNA序列與設(shè)計的干擾序列完全一致，見圖1，提示重組慢病毒載體質(zhì)粒Drp1-RNAi構(gòu)建成功。構(gòu)建的重組慢病毒載體質(zhì)粒Drp1-RNAi結(jié)構(gòu)見圖2。

注：兩個箭頭之間即為重組慢病毒載體質(zhì)粒Drp1-RNAi的DNA序列。

圖1 重組慢病毒載體質(zhì)粒Drp1-RNAi測序結(jié)果

2.2 穩(wěn)定干擾Drp1基因的神經(jīng)母細胞瘤細胞株的鑒定結(jié)果 D組Drp1 mRNA和蛋白的相對表達量為0.47±0.12和0.40±0.04，N組Drp1 mRNA和蛋白的相對表達量為1.12±0.33和0.67±0.05，C組Drp1 mRNA和蛋白的相對表達量為1.02±0.23和0.72±0.02；D組Drp1 mRNA和蛋白的相對表達量與N組、C組相比，P均<0.05；N組Drp1 mRNA和蛋白的相對表達量與C組相比，P均>0.05。

圖2 重組慢病毒載體質(zhì)粒Drp1-RNAi結(jié)構(gòu)圖

3 討論

PD近年的發(fā)病率明顯上升，調(diào)查顯示65歲以上人口PD患病率約為1.5%，給社會和經(jīng)濟發(fā)展帶來沉重的負擔(dān)[3]。研究[4]表明，線粒體分裂和融合的動態(tài)平衡被破壞與PD的發(fā)病密切相關(guān)。線粒體分裂和融合蛋白大多屬于高度保守的三磷酸鳥苷(GTP)蛋白家族，Drp1是其中調(diào)控線粒體分裂的關(guān)鍵分子，主要位于細胞漿。在線粒體分裂時，Drp1可被招募到線粒體外膜，富集于線粒體潛在分裂位點，通過GTP水解致線粒體分裂[5]。研究[6]發(fā)現(xiàn)，中腦多巴胺神經(jīng)元被敲除Drp1基因的小鼠可出現(xiàn)PD樣運動障礙，紋狀體內(nèi)多巴胺樣神經(jīng)終末和多巴胺的含量明顯減少，其多巴胺神經(jīng)元內(nèi)的線粒體明顯變長、運動變慢，軸突終末內(nèi)線粒體匱乏。研究[7]發(fā)現(xiàn)，果蠅中Drp1基因缺失可以引起線粒體的損傷，導(dǎo)致神經(jīng)肌肉接頭突觸傳遞的障礙，同樣線粒體的損耗影響了ATP生產(chǎn)，神經(jīng)肌肉接頭處突觸傳遞的能量供應(yīng)不足。總之，Drp1介導(dǎo)的線粒體斷裂與PD發(fā)病有著密切聯(lián)系。對Drp1的進一步研究，尤其是對它的作用方式和功能的研究，有助于闡明PD的發(fā)病機制，也為臨床治療新靶點的發(fā)現(xiàn)提供實驗依據(jù)。

RNA干擾(RNAi)技術(shù)是通過雙鏈RNA高效特異地降解同源基因mRNA，從而抑制細胞內(nèi)特定基因表達的一種基因沉默技術(shù)[8]。目前國內(nèi)外用于沉默基因表達的RNAi載體種類主要有質(zhì)粒、腺病毒和慢病毒等，每種載體各有特點。質(zhì)粒載體的速度快，流程相對簡單，但其轉(zhuǎn)染效率較低，約為37%左右，且多為瞬時轉(zhuǎn)染[9]；腺病毒載體包裝容量大，對人致病性低，能夠在增殖和非增殖細胞中感染和表達，但其攜帶的外源基因不易整合到宿主細胞體中，故不能達到持久抑制靶基因表達的效果[10]；慢病毒載體是以人類免疫缺陷型病毒為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因載體，與一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體相比，它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力，并可有效地將外源基因整合至宿主染色體上，從而達到持久性表達，具有感染譜廣、感染效率高及穩(wěn)定表達的優(yōu)勢[11,12]。本研究選取慢病毒構(gòu)建了靶向干擾Drp1基因的慢病毒載體，并成功轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細胞。本研究中，嘌呤霉素最低致死濃度篩選、慢病毒載體質(zhì)粒的構(gòu)建及測定，為后期獲得穩(wěn)定干擾Drp1基因的SH-SY5Y細胞模型奠定了基礎(chǔ)，之后進一步采用實時熒光定量PCR和Western blotting檢測Drp1 mRNA和蛋白的相對表達量，結(jié)果提示Drp1的表達被有效抑制，這為進一步了解Drp1與PD的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

綜上所述，為了探究Drp1與PD發(fā)病之間的關(guān)系，本研究通過構(gòu)建Drp1基因的siRNA慢病毒載體，建立穩(wěn)定干擾Drp1基因表達的SH-SY5Y細胞模型，為進一步研究Drp1基因在PD發(fā)病過程中的作用環(huán)節(jié)和機制奠定了模型基礎(chǔ)。