林婧楠，趙景壯，徐黎明，劉 淼，任廣明，盧彤巖

(1.上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306；2.中國水產科學研究院 黑龍江水產研究所，哈爾濱 150070；3.上海海洋大學國家水生動物病原庫，上海 201306)

鯉春病毒血癥(spring virernia of carp，SVC)是當前國際動物衛(wèi)生組織(Office International Des Epizooties，OIE)必報的重要疫病之一，也是2008年我國頒布的動物疫病名錄中的一類動物疫病[1]。該病常在春季爆發(fā)，能夠引起鯉科魚類大量死亡。該病最開始在中世紀歐洲大部分地區(qū)流行，我國首次報道是劉葒等[2]在2003年從無臨床癥狀的觀賞魚中分離出鯉春病毒血癥病毒(spring virernia of carp virus，SVCV)。目前該病已嚴重威脅我國淡水養(yǎng)殖以及觀賞魚的出口問題，因此建立良好的檢測方法尤為重要。

SVCV是一種高傳染性、高致病性的彈狀病毒[3]。從3′端到5′端編碼5種蛋白分別為核蛋白(Nuclear protein，N)、磷蛋白(Phosphoprotein，P)、基質蛋白(Matrixprotein，M)、糖蛋白(Glycoprotein，G)和RNA聚合酶(RNA polymerase，L)[4]。根據糖蛋白的核酸序列，可將SVCV分成Ia、Ib、Ic和Id 4個基因型[5]，而目前我國SVCV分離株的基因型均為Ia[6,7]。

G蛋白是位于病毒粒子上長釘狀的突起，因其含有抗原決定簇，在免疫應答方面起到決定性的作用[8,9]。目前，國內外大部分關于SVCV單克隆抗體和多克隆抗體的制備多基于G蛋白。本研究以SVCV黑龍江分離株shlj1為研究對象，通過對SVCV shlj1毒株G蛋白氨基酸序列進行跨膜區(qū)域及B細胞抗原表位預測，選取富含抗原表位的G蛋白基因片段進行體外原核表達及純化，以制備抗血清，建立SVCV的免疫學檢測方法，為SVC疫病監(jiān)測提供技術保障。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

毒株：課題組在東北地區(qū)養(yǎng)殖鯉流行病調查中分離保存5株毒株(黑龍江?。篠VCV-shlj1、SVCV-shlj2、SVCV-shlj3，遼寧?。篠VCV-ln201801、SVCV-ln201802)，其中SVCV-shlj1病毒滴度為106.28TCID50/mL[10]；細胞株：黑頭呆魚上皮細胞(Epithelioma papulosum cyprini，EPC)由中國水產科學研究院長江水產研究所魚類病害防治教研室曾令兵教授惠贈；載體：pET-32a表達載體由本實驗室保存。

限制性內切酶、rTaq酶、Trizol、DL2000 DNA Marker、大腸桿菌(E.coli)DH5α、BL21(DE3)感受態(tài)細胞、pMD18-T克隆載體、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver2.0試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司，T4連接酶購自NEB公司，DNA膠回收試劑盒、質粒DNA提取試劑盒購自OMEGA公司，HRP標記羊抗鼠IgG、FITC標記羊抗鼠IgG購自Abcam公司，異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)購自Sigma Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計

根據本實驗室分離保存的SVCV分離株shlj1的基因序列(NCBI登錄號：KX911973)，應用TMHMM Server在線分析軟件及DNAStar 6.0(Protean)軟件對G全長蛋白的跨膜區(qū)域及抗原指數進行分析預測，篩選出G截短蛋白的區(qū)域，在其上下游分別插入BamH I(GGATCC)或者SalI(GTCGAC)酶切位點，利用Primer Premier 5.0軟件設計用于擴增SVCV G截短蛋白基因的引物，根據其結果，上游引物為5′ GGATCCTGGATCGATCATGAATTCAATGGGG 3′，下游引物為5′ GTCGACAGTATATTCTACCACATTTTCC 3′，引物由長春庫美生物公司合成。

1.2.2 目的片段的擴增及重組質粒的構建

采用Trizol法提取SVCV shlj1毒株總RNA，以其為模板，利用TaKaRa公司的One Step RT-PCR Kit試劑盒擴增目的基因。將獲取的目的基因膠回收，克隆至pMD18-T simple載體中，通過菌液PCR鑒定，鑒定為陽性的單菌落經測序確認無誤，提取質粒命名為：pMD18-T-G。將pMD18-T-G質粒和pET-32a載體分別利用BamH I、SalI進行雙酶切，酶切產物膠回收后，利用T4連接酶，16 ℃連接過夜。將連接產物轉入DH5α感受態(tài)中，涂于含有氨芐青霉素抗性的LB平板中培養(yǎng)，挑取單菌落，進行菌液PCR鑒定。鑒定為陽性的菌落擴大培養(yǎng)后提取質粒進行酶切鑒定，最終鑒定正確的質粒命名為：pET-32a-G。

1.2.3 G蛋白的誘導表達

將pET-32a-G重組質粒轉入Rosetta表達菌株中。由于商業(yè)化的Rosetta表達菌株已經含有一個增強外源蛋白表達的質粒，因此本研究利用PCR方法對重組菌進行鑒定。挑取陽性的重組菌，接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)至OD600值為0.5左右，向其中添加終濃度為0.25 mmol/L的IPTG，分別在未誘導前，以及誘導后2-6 h，每隔1 h，取2 mL菌液，離心(1 min，10 000 r/min)。用PBS重懸菌體后超聲破碎，留取破碎后的全菌、菌液上清和菌液沉淀，并向其中加入蛋白上樣緩沖液后煮沸，利用12% SDS-PAGE電泳對重組蛋白誘導表達情況進行分析。

1.2.4 重組G蛋白的純化

收集誘導后(37 ℃，6 h)的陽性重組菌(500 mL)，采用蛋白變性復性的方法對超聲破碎的菌體進行純化[11]，經變性液(含有8 mol/L尿素)變性12 h及復性液(含有2 mol/L尿素)復性8 h處理后，將復性后的蛋白樣離心，上清放置透析袋中，置于PBS緩沖液中透析36 h，每12 h換液。利用超微量核酸蛋白測定儀(ScanDrop200，德國耶拿)測定純化后蛋白的濃度，并利用12% SDS-PAGE電泳對純化后的蛋白進行分析。將純化后蛋白用細菌過濾器過濾后，分裝在無菌的EP管中，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.5 試驗動物的免疫及血清收集

將純化后的重組G蛋白作為免疫原，選取6-8周齡、體重在20 g左右的雌性Balb/c小鼠，采用背部皮下多點注射法進行免疫。G蛋白的免疫劑量為1 mg/kg，首免采用等體積的G蛋白與完全弗氏佐劑乳化免疫小鼠，10 d、20 d后進行第2、3次免疫，采用等體積的G蛋白與不完全弗氏佐劑乳化免疫小鼠。同時設立對照組，用PBS緩沖溶液代替純化后G蛋白與乳化劑乳化免疫。第三次免疫結束10 d后，眼球采血，將血液置于37 ℃靜置1 h左右，3 000 r/min離心10 min分離出清亮的血清，分裝于無菌的EP管中，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.6 抗體效價的分析

采用ELISA對抗體的效價進行分析，設置空白組(PBS稀釋液)、陰性對照組(未免疫的小鼠血清)和實驗組(鼠1、鼠2)。以純化后的G蛋白作為酶標試劑板的包被物(終濃度為0.025 mg/mL)，每孔100 μL，4 ℃包被過夜；以制備的鼠抗血清為一抗，設置一定的稀釋倍數(1∶10 000、20 000、40 000、80 000、160 000)，37 ℃孵育1 h；以HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗(1∶10 000，稀釋)，37 ℃孵育1 h；多次洗滌后，加入TMB顯色液，37 ℃避光孵育10 min；最后，加入50 μL終止液終止反應，在酶標儀下檢測OD450nm。當ΔA=(A檢測孔-A空白孔)/(A陰性孔-A空白孔)>2.1時，結果為陽性。出現陽性時最大稀釋倍數即為抗體效價[12]。

1.2.7 間接免疫熒光抗體試驗

在六孔板中制備EPC細胞爬片，待細胞長至90%時，以MOI(multiplicity of infection)0.1接種實驗室保存的五株SVCV分離株，黑龍江3株(shlj1、shlj2和shlj3)及遼寧2株(ln201801和ln201802)，同時設置不接種任何病毒的細胞為陰性對照組。當細胞出現CPE時，吸出培養(yǎng)液，用PBS多次清洗板孔后加入4%的多聚甲醛固定30 min；PBS再次清洗后加入細胞通透液進行室溫通透20 min；將本實驗制備的鼠抗血清(1∶1 000)以及FITC標記的羊抗鼠IgG(1∶500)，依次加入到六板孔中，在37 ℃下各孵育1 h，最終用PBS清洗3次后，于熒光顯微鏡下觀察結果。

2 結果與分析

2.1 G蛋白抗原指數預測

利用TMHMM Server在線分析軟件對SVCV G蛋白的跨膜區(qū)域分析，結果顯示該蛋白存在一個跨膜區(qū)域，位于468～487 aa(圖1A)。同時利用DNAStar 6.0(Protean)軟件對SVCV G蛋白抗原指數進行預測，結果如圖1B所示。SVCV G全長蛋白平均抗原指數為1.025，其中1-160 aa區(qū)域平均抗原指數為1.009，且含有一段低抗原性的信號肽；161-300 aa區(qū)域蛋白平均抗原指數為1.048；301-500aa區(qū)域蛋白平均抗原指數為1.035。因此，本研究選定抗原指數最高的非跨膜區(qū)域的氨基酸序列(161-300 aa，140 aa)作為原核表達的目標蛋白序列。

2.2 重組質粒的構建及G蛋白的誘導表達

以SVCV shlj1病毒懸液提取的總RNA為模板，利用One Step RT-PCR Kit試劑盒擴增目的基因，1%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示為單一特異性條帶，且與預期設計的大小相符(420 bp，圖2)。將G基因克隆至表達載體構建重組質粒pET-32a-G，并將其轉入DH5α感受態(tài)中，經菌液PCR鑒定，出現與目的條帶大小相吻合的單一特異性條帶(420 bp，圖3)。將菌液PCR鑒定為陽性的菌株，接種于LB液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)后提質粒，進行酶切鑒定，可以看到重組質粒經BamH I或SalI單酶切后得到的單酶切產物與pET-32a-G質粒大小相符(6 320 bp，圖4)；而經BamH I和SalI雙酶切得到的雙酶切產物與目的片段大小相符(420 bp，圖4)。將該陽性重組質粒pET-32a-G轉入Rosetta表達菌株，利用PCR方法再次進行鑒定，結果顯示獲得的條帶大小與目的片段相符(420 bp，圖5)。

圖1 G蛋白的跨膜區(qū)及抗原指數預測Fig.1 The transmembrane domain and antigenic determinants analysis of SVCV G proteinA：跨膜區(qū)域預測；B：抗原指數分析

圖2 G基因PCR擴增的凝膠電泳分析Fig.2 Agarose gel analysis of G gene PCR productM.DL2000分子質量標準；1-2.G基因片段PCR產物

圖3 pET-32a-G重組質粒PCR鑒定Fig.3 PCR identification of pET-32a-G recombinant plasmidM.DL2000分子質量標準；1.PCR陰性對照；2-6.PCR陽性鑒定產物

圖4 pET-32a-G重組質粒酶切鑒定Fig.4 Dual-digestion of pET-32a-G recombinant plasmidM1.DL15000分子質量標準；1.pET-32a-G質粒；2.BamH I單酶切；3.Sal I單酶切；4.BamH I和Sal I雙酶切；M2.DL2000分子質量標準

圖5 含pET-32a-G質粒的Rosetta表達菌PCR鑒定Fig.5 PCR identification of the Rosetta carrying pET-32a-GM.DL2000分子質量標準；1.陰性對照；2-7.陽性鑒定產物

2.3 重組G蛋白的誘導表達

將未誘導的重組菌和誘導后重組菌的全菌、上清、沉淀進行SDS-PAGE電泳分析，結果顯示沉淀中有明顯的蛋白條帶且大小與預期相符(35 kDa)，而上清中未見目的條帶(圖6)。該結果說明重組G蛋白主要存在于沉淀中，以包涵體的形式進行表達；將陽性重組菌在37 ℃條件下誘導0～6 h，收集菌體沉淀，進行SDS-PAGE電泳分析，結果顯示隨著誘導時間的不斷增加，目的蛋白含量不斷增加，且誘導6 h時的蛋白表達量相對最高(圖7)。因此，在后續(xù)試驗中均選擇6 h做為最佳誘導時間。

2.4 重組G蛋白的純化

將重組G蛋白大量表達(37 ℃，6 h)，收集菌體超聲破碎，離心后用復性液對菌體進行多次清洗，向菌體中加入變性液，經變性過夜、復性8 h以及PBS緩沖液透析24 h后，對樣品進行12% SDS-PAGE分析。結果顯示，純化后的G蛋白為單一條帶，與目的條帶大小相符，約為35 kDa(圖8)。

圖6 G蛋白可溶性分析Fig.6 Soluble analysis of G proteinM.蛋白分子質量標準；1.未誘導的菌體蛋白；2.誘導后的菌體總蛋白；3.誘導后的菌體上清蛋白；4.誘導后的菌體沉淀蛋白

圖7 不同誘導時間對G蛋白表達的影響Fig.7 G protein expression induced for different timesM.蛋白分子質量標準；1.未誘導的菌體蛋白；2-6.誘導2～6 h的菌體蛋白

圖8 純化后的G蛋白Fig.8 Purified G proteinM.蛋白分子質量標準；1.純化后的G蛋白

2.5 鼠抗血清效價的分析

對Balb/c小鼠進行3次免疫注射后，眼球取血，分離血清。以純化后的重組G蛋白(終濃度為0.025 mg/mL)作為抗原包被酶標反應孔，以不同稀釋度的鼠抗血清為一抗，HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗(1∶10 000)，進行ELISA檢測，結果顯示鼠抗血清稀釋倍數為(10 000、20 000、40 000、80 000)時，滿足ΔA>2.1，均呈陽性，與對照組相比差異顯著(P<0.05)。稀釋倍數為160 000時，ΔA<2.1，呈陰性(圖9)。因此，本研究所制備的鼠抗SVCV G蛋白血清效價為1∶80 000。

圖9 抗SVCV G蛋白血清效價的ELISA分析Fig.9 ELISA analysis of mouse anti-SVCV G sera

2.6 IFAT的建立及應用

將5株SVCV分離株(黑龍江3株：shlj1、shlj2、shlj3和遼寧2株：ln201801、ln201802)接種于EPC細胞爬片，待細胞病變后，收獲病變的細胞進行固定和透化處理。然后分別加入制備的鼠抗血清為一抗，FITC標記的羊抗鼠IgG為二抗，進行間接免疫熒光抗體試驗，設置不接種任何病毒的細胞為陰性對照組。結果顯示，制備的鼠抗SVCV G截短蛋白血清均能與這5株SVCV分離株反應，產生特異性綠色熒光，而陰性對照組未見特異性熒光(圖10)。

3 討論

SVC是OIE必報的重要疫病，也是我國水生動物疫病監(jiān)測計劃的主要疫病之一。該病一旦爆發(fā)將會嚴重影響到我國鯉科魚類養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。因此，建立精準、快速的SVCV免疫學檢測方法尤為重要[12]。當前用于檢測的免疫血清通常是將滅活病毒免疫實驗動物來獲得，該方法需要增殖大量病毒，操作復雜，成本高[13]。隨著分子生物學的發(fā)展，重組表達外源病毒蛋白已成為制備出高效的免疫血清的主要手段。SVCV G蛋白做為病毒入侵細胞的介體，直接參與病毒感染的過程，同時作為最主要的保護性抗原，有較強的免疫原性，能夠決定血清型，是最常被用來制備免疫血清的蛋白[14]。

目前，SVCV G蛋白已在大腸桿菌、畢赤酵母和昆蟲細胞中成功表達[15-17]。但無論是利用畢赤酵母還是桿狀病毒表達SVCV G蛋白，均存在著表達量較低的缺點[18]。雖然原核表達系統(tǒng)無法對外源蛋白進行糖基化、磷酸化等翻譯后的加工修飾，但其表達產物仍然具有較高的免疫原性，已被廣泛應用于抗體的制備。如已利用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達的抗原制備了IHNV及IPNV的抗體[11,19]，并且這些抗體已經成功應用到病毒的血清學檢測。因此，考慮到原核表達系統(tǒng)操作簡單，成本低以及表達量高的優(yōu)點，本研究選用大腸桿菌表達系統(tǒng)來表達SVCV G蛋白。蘭文升等[13]將SVCV-741毒株G蛋白全長基因直接克隆至表達載體，發(fā)現SVCV G蛋白存在于上清，純化后的蛋白濃度為1.7 mg/mL。而徐進等[20]采用截短表達方式去掉SVCV-HN毒株G蛋白兩端的疏水區(qū)，結果證明截短表達的G蛋白濃度較高(4 mg/mL)。因此，本研究利用DNAStar 6.0(Protean)軟件對SVCV G蛋白抗原指數進行預測，僅保留抗原指數最高的非跨膜區(qū)域(161～300 aa)進行截短表達。結果顯示，本研究截短表達的SVCV G蛋白存在于沉淀當中，純化后的蛋白濃度可高達4.2 mg/mL，且純化的G蛋白條帶單一，足夠用于鼠抗血清的制備。經ELISA檢測證明利用該截短G蛋白制備的鼠抗血清效價可高達1∶80 000。將該鼠抗血清應用于北方地區(qū)分離出的5株SVCV毒株的IFAT檢測試驗，結果顯示本研究所制備的鼠抗血清能夠識別SVCV表面天然結構G蛋白，均能與這5株SVCV分離株發(fā)生特異性反應，產生特異性熒光。上述結果表明，純化的重組G蛋白具有良好的免疫原性，能夠刺激機體產生特異性抗體。紀鋒等[21]曾對SVCV-shlj1毒株G蛋白的抗原指數、親水性指數以及柔性區(qū)域進行了預測分析，結果發(fā)現SVCV-shlj1毒株G蛋白可能存在5個優(yōu)勢抗原表位區(qū)域，分別為4～26 aa、145～157 aa、293～302 aa、315～327 aa、407～491 aa。本研究所選區(qū)域含有其中1個優(yōu)勢抗原表位區(qū)域(293～302 aa)。該優(yōu)勢抗原表位可能是本研究SVCV截短G蛋白具有良好免疫原性的主要原因。

圖10 鼠抗SVCV G蛋白血清間接免疫熒光檢測Fig.10 IFA result of the mouse antisera against SVCV G proteinA.陰性對照組(正常EPC細胞)；B.SVCV-shlj1；C.SVCV-shlj2；D.SVCV-shlj3；E.SVCV-ln201801；F.SVCV-ln201802

目前我國SVCV現行基因型為Ia基因型。因此本研究選取Ia基因型的SVCV-shlj1毒株進行抗原制備。利用該抗原制備的鼠抗血清能夠識別不同區(qū)域的5株SVCV分離株，該結果表明，本研究制備的鼠抗SVCV G蛋白血清可應用于全國范圍的SVCV血清學檢測。