王 涵，張 珊，薛士鵬，宋國英，于瑞雪，劉慶春，王中曉，張慶遠(yuǎn)，劉 麗，李冰潔，夏西超,

(1.南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，河南南陽 473061；2.平頂山學(xué)院醫(yī)學(xué)院，河南平頂山476000)

熱休克蛋白(HSP)是一個(gè)超基因家族，在調(diào)節(jié)機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)和耐受性方面發(fā)揮重要作用[1,2]。在正常和應(yīng)激條件下，HSP幫助蛋白質(zhì)折疊、膜轉(zhuǎn)位、錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)降解等方面具有積極作用[3,4]。根據(jù)其分子量不同，HSP可以分為HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和小分子HSP20等5個(gè)家族。HSP60是最為保守且研究相對(duì)廣泛的家族之一，當(dāng)生物細(xì)胞或個(gè)體受到物理、 化學(xué)、重金屬、有機(jī)污染物、病原物等因素脅迫時(shí)，HSP60 參與熱激反應(yīng)中的蛋白質(zhì)合成、線粒體DNA代謝、細(xì)胞內(nèi)多肽折疊、受損線粒體蛋白運(yùn)輸?shù)戎匾磉^程，以自發(fā)減少機(jī)體損傷[5,6]。多溴聯(lián)苯醚(PBDE)是常見淡水持久性有機(jī)污染物，具有持久性和高生物蓄積的特點(diǎn)，已經(jīng)引起學(xué)者的極大關(guān)注[7]。PBDE-47是水體中最豐富的有機(jī)污染物，其生物毒性顯著強(qiáng)于其他溴化化合物[8]。前期研究表明，PBDE-47處理可能導(dǎo)致淡水背角無齒蚌(Anodontawoodiana)機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)和急性毒性效應(yīng)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步探究[8]。在本研究中，從背角無齒蚌中克隆出AwHSP60完整基因序列，通過real-time PCR分析AwHSP60表達(dá)，為揭示PBDE-47毒性效應(yīng)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 背角無齒蚌處理

實(shí)驗(yàn)用背角無齒蚌購自南陽市水產(chǎn)市場(殼長6.5±0.5 cm)，實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)水循環(huán)系統(tǒng)中養(yǎng)殖2周。PBDE-47購自Sigma-Aldrich(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)，溶解于二甲亞砜(DMSO)中以制備儲(chǔ)備液。動(dòng)物處理實(shí)驗(yàn)在長方形塑料盒(40 cm×25 cm；10 cm 高)中進(jìn)行，飼養(yǎng)采用人工模擬池塘水(每1 L去離子水中含48 mg NaHCO3、33 mg CaCl2·2H2O、60 mg MgSO4·7H2O和0.5 mg KCl)[8]。將來自同一塑料盒5只動(dòng)物進(jìn)行解剖，取斧足、鰓、肝胰臟、閉殼肌、心臟、血淋巴和外套膜等組織，并迅速放入液氮保存，用于RNA提取。用同樣的方法，將80只河蚌隨機(jī)飼養(yǎng)于10個(gè)塑料盒中，8只/盒，分為對(duì)照組和PBDE-47處理組，每組5個(gè)盒子。PBDE-47 處理組采用3.36 μg/L的PBDE-47進(jìn)行處理，對(duì)照組用同體積DMSO處理，水中DMSO濃度不超過3‰。第0、1、3、6、9、12 和 15 d從每組中取出5只河蚌，解剖肝胰臟、鰓和血淋巴，液氮速凍，于-80 ℃保存。

1.2 總RNA提取和cDNA第一鏈的合成

總RNA提取采用TRIzol試劑(寶生物生物有限公司，大連)，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，具有完整mRNA條帶的RNA用于合成cDNA，M-MLV試劑盒合成第一鏈cDNA，用作PCR反應(yīng)模板[8]。

1.3 背角無齒蚌AwHSP60核心片段的擴(kuò)增

簡并引物AwHSP61和AwHSP62分離AwHSP60 cDNA保守區(qū)域片段，反應(yīng)條件：94℃ 4 min，1cycle;94℃ 40s，48℃ 40s，72℃ 50s，32cycles；72℃ 10min，1cycle。PCR產(chǎn)物連接至pMDT-19載體，雙向測序、NBCI比對(duì)確定為HSP60核心片段。確定HSP60部分cDNA序列后，根據(jù)部分cDNA序列設(shè)計(jì)的特異性引物(表1)，按照試劑盒要求，5′Race Outerprimer和AwHSP60-5-1進(jìn)行第一次擴(kuò)增，以反應(yīng)產(chǎn)物為模板，反應(yīng)條件為：94℃ 4min 1cycle;94℃ 40s，58℃ 40s，72℃ 50s，20 cycles；72℃ 10min，1cycle。5′Race Innerprimer和AwHSP60-5-2進(jìn)行第二次擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94℃ 4min 1cycle;94℃ 40s，60℃ 40s，72℃ 50s，30cycles；72℃ 10min，1cycle。3′Race Outerprimer和AwHSP60-3-1進(jìn)行第一次擴(kuò)增，以反應(yīng)產(chǎn)物為模板，反應(yīng)條件為：94℃ 4min 1cycle;94℃ 40s，58℃ 40s，72℃ 50s，20cycles；72℃ 10min，1cycle。3′Race Innerprimer和AwHSP60-3-2進(jìn)行第二次擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94℃ 4min 1cycle;94℃ 40s，60℃ 40s，72℃ 50s，30cycles；72℃ 10min，1cycle。擴(kuò)增AwHSP60 cDNA5′和3′區(qū)域序列進(jìn)行雙向測序，5′RACE和3′RACE的PCR產(chǎn)物用DNAMAN軟件進(jìn)行拼接。

1.4 序列和系統(tǒng)發(fā)育分析

分析AwHSP60序列，通過GenBank 數(shù)據(jù)庫搜索(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)進(jìn)行BLAST程序比對(duì)；根據(jù)http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP 預(yù)測信號(hào)肽；采用Simple Modular Architecture Research Tool(http://smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；使用DANMEN分析程序?qū)wHSP60基因進(jìn)行多序列比對(duì)；通過Swiss-model(http://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測；AwHSP60的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)；使用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列Tab.1 PCR amplified primer sequences

1.5 AwHSP60 mRNA水平定量檢測

為了確定AwHSP60轉(zhuǎn)錄水平，采用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒并按照要求進(jìn)行定量分析。β-actin作為內(nèi)參基因，根據(jù)AwHSP60-F和AwHSP60-R引物常用PCR儀中分離靶基因(表1)，瓊脂糖凝膠電泳僅檢測出一個(gè)條帶，PCR產(chǎn)物測序，序列鑒別。使用ABI7500實(shí)時(shí)檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems，美國)進(jìn)行real-time PCR，20 μL體系中包括：SYRB Premix ExTaqTM(TaKaRa)10 μL，PCR上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，cDNA模板2 μL，ROX Reference Dye(TaKaRa)0.4μL，dH2O 6.8μL。反應(yīng)條件：95℃ 30s， 1cycle;95℃ 5s，60℃ 34s， 40cycles，通過2-△△CT分析AwHSP60表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件，AwHSP60 基因表達(dá)水平以±s表示，假設(shè)檢驗(yàn)采用單因素方差分析(ANOVA)，組間多重比較采用SNK法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 背角無齒蚌AwHSP60基因cDNA序列和預(yù)測蛋白質(zhì)序列分析

AwHSP60 cDNA序列由1 940 bp核苷酸序列組成，包含一個(gè)69 bp的5′-端非編碼區(qū)、167 bp的3′-端非編碼區(qū)和一個(gè)1 704 bp的開放閱讀框。開放閱讀框由一個(gè)568個(gè)氨基酸組成的多肽，分子量為61.03 kDa，等電點(diǎn)為5.91(圖1)。終止信號(hào)(AATAAA)位于3′-端非編碼區(qū)的2 000-2 005位點(diǎn)位置(圖1)。AwHSP60氨基酸序列包線粒體定位靶序列(1-MYRLPSILRPVLTRHLAPCLSRAY-24)、HSP60 家族標(biāo)簽序列(428-AAVEEGIVPGGG-439)、三個(gè)ATP/ADP 結(jié)合位點(diǎn)(52-TMGPKG-57，74-DG VTVAKGI-8，193-RDGVITVKDGKTLHDELEV-210)、Mg2+結(jié)合位點(diǎn)(107-AGDGTTAATVL-117)，3′末端典型GGM重復(fù)基序和負(fù)責(zé)從中間結(jié)構(gòu)域到頂部轉(zhuǎn)位區(qū)(213-EGMKFDRGYISPYFINTQKG-232)等HSP60家族多個(gè)保守結(jié)構(gòu)域(圖 1)。

2.2 背角無齒蚌AwHSP60 的進(jìn)化關(guān)系

BLAST結(jié)果表明，AwHSP60氨基酸序列與其他HSP60家族成員親緣關(guān)系較近，AwHSP60氨基酸序列與淡水三角帆蚌、光滑雙臍螺和加州海兔同源性分別為97.71%、80.21%和76.95%。此外，AwHSP60氨基酸序列與模式生物之間也存在高度同源性，與人、小鼠、斑馬魚和果蠅同源性分別為75.74%、76.27%、73.91%和71.18%。從脊椎動(dòng)物和無脊椎物種選擇不同 HSP60家族成員，通過MEGA5.0鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析AwHSP60的進(jìn)化關(guān)系。AwHSP60進(jìn)化上與雙殼類和腹足綱動(dòng)物親緣關(guān)系最近，魚類和哺乳動(dòng)物次之，甲殼動(dòng)物較遠(yuǎn)，細(xì)菌親緣關(guān)系最遠(yuǎn)(圖2)。

圖1 背角無齒蚌AwHSP60基因的cDNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 The cDNA sequences of A.woodiana AwHSP60 gene and deduced amino acid sequences□:HSP60基因標(biāo)簽序列，—：ATP/ADP 結(jié)合位點(diǎn)，：線粒體定位序列，……:Mg2+ 結(jié)合位點(diǎn)，*:終止密碼子，：poly A信號(hào)序列

2.3 背角無齒蚌AwHSP60組織分布

Real-timePCR結(jié)果顯示，AwHSP60廣泛表達(dá)于背角無齒蚌的斧足、鰓、心臟、肝胰臟、血淋巴、閉殼肌和外套膜(圖3)。AwHSP60 mRNA在肝胰臟和鰓中表達(dá)水平最高，血淋巴、外套膜和心臟表達(dá)水平次之，斧足和閉殼肌中表達(dá)水平最低(圖 3)。

2.4 PBDE-47 對(duì)背角無齒蚌AwHSP60 表達(dá)的影響

正常情況下，AwHSP60在動(dòng)物肝胰臟、鰓和血淋巴穩(wěn)定表達(dá)，PBDE-47處理組后 AwHSP60表達(dá)受到顯著影響。在第1 d至15 d，PBDE-47處理后肝胰臟中AwHSP60 mRNA水平隨時(shí)間顯著上調(diào)(圖4)；與對(duì)照組相比，AwHSP60 mRNA水平在第1d增加了89.9%；第15天，AwHSP60 mRNA水平增加了6.73倍(圖4)。與對(duì)照組相比，PBDE-47處理后鰓中AwHSP60 mRNA水平在第1天至15天增加了2.09 倍(P<0.01)(圖 5)。與對(duì)照組相比，PBDE-47處理后血淋巴中 AwHSP60 mRNA水平增加了2.13倍(P<0.05)(圖 6)。

圖2 根據(jù)背角無齒蚌AwHSP60氨基酸序列使用鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed by adjacency method which according to the A.woodiana AwHSP60 amino acid sequences

圖3 背角無齒蚌AwHSP60基因的空間表達(dá)Fig.3 The spatial expression of A.woodiana AwHSP60 gene每組數(shù)據(jù)來源于3只動(dòng)物，重復(fù)3次

3 討論

背角無齒蚌屬于淡水底棲生物，以水體的懸浮物質(zhì)為食物進(jìn)行濾食生活，是水體污染重要評(píng)價(jià)生物之一。本研究中，通過分析背角無齒蚌肝胰臟、鰓和血細(xì)胞中AwHSP60基因的轉(zhuǎn)錄水平，探討暴露PBDE-47毒性作用機(jī)制 。

圖4 PBDE-47對(duì)背角無齒蚌肝胰腺AwHSP60基因表達(dá)的影響Fig.4 The effection of PBDE-47 on A.woodiana hepatopancreas AwHSP60 gene expressionn=5；“*”“**”表示與相應(yīng)對(duì)照組相比有顯著或極顯著差異(P<0.05，P<0.01),圖5,6同

AwHSP60 有一個(gè)連續(xù)性開放閱讀框，包括ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)換區(qū)域和保守結(jié)構(gòu)域。對(duì)于多數(shù)基因而言，蛋白序列通常與無脊椎動(dòng)物、植物和細(xì)菌存在較高的相似性[9,10]。AwHSP60蛋白序列與軟體動(dòng)物、脊椎動(dòng)物、甲殼動(dòng)物和昆蟲具有高度同源性，其蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)為29.23(<40)，提示AwHSP60具有高度穩(wěn)定性，并排除來自原核生物的可能性。AwHSP60中有一個(gè)高度保守的線粒體靶定位序列，提示AwHSP60可能是一個(gè)線粒體分子伴侶[11,12]。在 C 末端區(qū)域，AwHSP60有一個(gè)GGM重復(fù)序列，該結(jié)構(gòu)能夠提供疏水作用表面，在促進(jìn)折疊中間體重排過程中發(fā)揮積極作用[13,14]。基于AwHSP60與 HSP60家族成員之間存在高度保守相似性，AwHSP60可能在應(yīng)激環(huán)境條件下新生蛋白質(zhì)折疊過程中發(fā)揮作用。序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，從軟體動(dòng)物到昆蟲，到脊椎動(dòng)物，HSP60結(jié)構(gòu)和進(jìn)化譜系高度保守。背角無齒蚌和三角帆蚌HSP60基因存在更為親近進(jìn)化關(guān)系，提示這兩個(gè)物種來自同一祖先。AwHSP60進(jìn)化上與雙殼類和腹足綱動(dòng)物親緣關(guān)系最近，魚類和哺乳動(dòng)物次之，甲殼動(dòng)物較遠(yuǎn)，細(xì)菌親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，提示雙殼類和腹足綱動(dòng)物從無脊椎動(dòng)物分離出來后形成了一個(gè)新的分支。背角無齒蚌AwHSP60 mRNA水平具有廣泛的分布模式，這種分布模式與AwHSP60參與的環(huán)境適應(yīng)性和耐受性相關(guān)。肝胰臟是軟體動(dòng)物主要消化、吸收和分泌器官，對(duì)環(huán)境變化特別敏感[15]。鰓是環(huán)境中污染物進(jìn)入機(jī)體主要入口，并能與其直接接觸[16]。雙殼類循環(huán)系統(tǒng)是一個(gè)血液和淋巴液混合在一起的開放式循環(huán)系統(tǒng)，血淋巴在淋巴管、血竇和全身軟組織中流通。黏膜組織的血淋巴填盈充足，這些器官與周圍環(huán)境進(jìn)行氧氣的交換或營養(yǎng)素提取有關(guān)。血淋巴是應(yīng)對(duì)環(huán)境應(yīng)激一個(gè)重要防線[16]。肝胰臟、鰓和血細(xì)胞在維護(hù)動(dòng)物穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，也是環(huán)境因素作用的靶點(diǎn)[16]。由此可見，肝胰臟、鰓和血淋巴中AwHSP60高表達(dá)與背角無齒蚌應(yīng)對(duì)環(huán)境的耐受性密切相關(guān)。

圖5 PBDE-47對(duì)背角無齒蚌腮AwHSP60基因表達(dá)的影響Fig.5 The effect of PBDE-47 on A.woodiana gill AwHSP60 gene expression

圖6 PBDE-47對(duì)背角無齒蚌血淋巴AwHSP60基因表達(dá)的影響Fig.6 The effect of PBDE-47 on A.woodiana hemolymph AwHSP60 gene expression

在本研究中，PBDE-47處理可顯著誘導(dǎo)肝胰臟、鰓和血淋巴中 AwHSP60表達(dá)水平，提示背角無齒蚌能夠通過上調(diào)AwHSP60表達(dá)提高對(duì)PBDE-47暴露的耐受能力。背角無齒蚌作為濾食性淡水生物，靠過濾水體中營養(yǎng)物質(zhì)來維持生存。PBDE具有較高的親脂性，水中溶解PBDE很容易蓄積在細(xì)胞和組織中，導(dǎo)致活性氧(ROS)大量產(chǎn)生和機(jī)體氧化應(yīng)激。正常情況下，ROS會(huì)很快被一系列抗氧化酶清除，維持在一個(gè)合理水平。氧化應(yīng)激條件下，過量生成ROS可引起DNA損傷、脂質(zhì)過氧化和蛋白質(zhì)糖基化，造成蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊幾率增加。HSP表達(dá)上調(diào)有助于錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)進(jìn)行修復(fù)、蛋白質(zhì)膜轉(zhuǎn)位、錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)降解，提高環(huán)境適應(yīng)性。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，水體柴油污染后能夠?qū)е掳臀髂迪牭啮w和消化腺中HSP60表達(dá)水平顯著上調(diào)，水體殘留的抗抑郁藥物氟西汀能夠誘導(dǎo)河蜆消化腺中HSP60和HSP70 mRNA水平上調(diào)[17]。干擾蛋白質(zhì)正確折疊是環(huán)境污染物影響機(jī)體功能重要路徑之一，激活HSP表達(dá)是動(dòng)物恢復(fù)正常生理功能和提高適應(yīng)性的關(guān)鍵策略。低等生物缺乏后天免疫系統(tǒng)，軟體動(dòng)物上調(diào)HSP60表達(dá)應(yīng)對(duì)溫度、病原物、重金屬和污染物的影響具有重要意義[17]。AwHSP60表達(dá)上調(diào)是背角無齒蚌應(yīng)對(duì) PBDE-47引起氧化應(yīng)激的重要手段之一。

肝胰臟中 AwHSP60 mRNA水平的上調(diào)表現(xiàn)出時(shí)間依賴性模式，提示這可能與動(dòng)物機(jī)體代償機(jī)制有關(guān)。動(dòng)物長期暴露PBDE-47環(huán)境中，機(jī)體通過適應(yīng)性機(jī)制處理應(yīng)激效應(yīng)，并逐漸恢復(fù)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。作為一種細(xì)胞內(nèi)分子伴侶，HSP60參與細(xì)胞內(nèi)外免疫調(diào)控并保護(hù)細(xì)胞免受環(huán)境應(yīng)激損害，HSP60常表現(xiàn)出一種時(shí)間依賴性表達(dá)方式[18,19]。整個(gè)實(shí)驗(yàn)觀察過程中，背角無齒蚌鰓中AwHSP60表達(dá)呈倒U型曲線，早期上調(diào)，中期達(dá)到峰值，后期下降，提示這種現(xiàn)象可能與動(dòng)物對(duì)持續(xù)產(chǎn)生氧化應(yīng)激的耐受能力有關(guān)。隨著PBDE-47處理時(shí)間延長，PBDE-47在體內(nèi)不斷蓄積，將不斷產(chǎn)生ROS，導(dǎo)致細(xì)胞承受逐漸增加的氧化應(yīng)激效應(yīng)，機(jī)體通過上調(diào)HSP 表達(dá)減少錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)產(chǎn)生，增強(qiáng)耐受性[20]。一旦PBDE-47產(chǎn)生氧化應(yīng)激水平達(dá)到峰值并超出細(xì)胞耐受能力，巨大應(yīng)激效應(yīng)將導(dǎo)致細(xì)胞損傷、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡[21,22]。這種情況下，如果動(dòng)物缺乏產(chǎn)生新細(xì)胞去補(bǔ)償死亡細(xì)胞的能力，活細(xì)胞數(shù)量將逐漸降低[23,24]。值得注意是，肝胰臟、鰓和血淋巴中AwHSP60表達(dá)呈現(xiàn)不同的時(shí)空特征，提示該表達(dá)模式可能組織功能相關(guān)。軟體動(dòng)物肝胰臟具有肝臟和胰腺的雙重功能，參與消化和中和大量毒素[15]。鰓與外部環(huán)境直接接觸，作為環(huán)境污染物主要入口[16]。蚌類淋巴細(xì)胞是抵御病原體入侵的重要屏障[16]。

本研究從背角無齒蚌克隆出AwHSP60全基因序列，該基因包含HSP60家族高度保守的標(biāo)簽序列。PBDE-47處理可顯著上調(diào)肝胰臟、鰓和血淋巴中 AwHSP60 表達(dá)水平，其原因與增強(qiáng)動(dòng)物對(duì)氧化應(yīng)激的耐受能力有關(guān)。