鞠曉聰 鄭凱 徐明 韓加 王文劍 王景明 宋帥 李泉 魯亞杰 于秀淳

自規(guī)范性化療及廣泛性腫瘤切除手術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用以來，國內(nèi)外文獻(xiàn)報道骨肉瘤患者 5 年生存率從30 年前的不足 20% 提高到 60%～80%[1-4]。新輔助化療藥物包括順鉑 ( D )、多柔比星 ( A )、甲氨蝶呤( M ) 和異環(huán)磷酰胺 ( I )，足夠的化療藥物劑量和恰當(dāng)?shù)幕煼桨甘潜ＷC患者治療效果的基礎(chǔ)[5]。隨著生存率的提高，患者的生存質(zhì)量是需要關(guān)注的一個問題。1948 年，Spitz[6]首次報道高劑量化療藥物會對患者性腺造成損傷，部分損傷甚至不可逆，對患者心理及生活產(chǎn)生不良影響[7]。

目前肢體骨肉瘤患者接受化療后順利生育子女的文獻(xiàn)報道較少[8-11]，2000 年 Longhi 等[8]報道長期生存的 92 例女性骨肉瘤中，有 14 例共生育 19 名子女；2003 年 Longhi 等[9]報道 96 例男性骨肉瘤中，8 例共生育 12 名子女；2004 年，Durrieu 等[10]報道1 例骨肉瘤生育 1 名后代；同年 Harish 等[11]報道長期生存的 36 例骨肉瘤中，接受治療后有生育需求的15 例共生育 22 名子女，但對肢體骨肉瘤患者子女健康狀況的隨訪尚無報道。骨肉瘤患者體細(xì)胞存在染色體不穩(wěn)定性，具有較高的腫瘤發(fā)生風(fēng)險，這種不穩(wěn)定性可能通過遺傳方式傳給子代，使子代對腫瘤的易感性增加[12]。

本研究目的：( 1 ) 評價規(guī)范化治療肢體骨肉瘤長期生存患者的生育能力；( 2 ) 評價骨肉瘤患者子女健康狀況。

材料與方法

一、納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn)

1. 納入標(biāo)準(zhǔn)：( 1 ) 2000 年 6 至 2016 年 3 月在解放軍九六○醫(yī)院和西京醫(yī)院行肢體骨肉瘤規(guī)范化治療后長期生存并可能生育者；( 2 ) 原發(fā)部位為四肢長骨骨肉瘤者；( 3 ) 接受規(guī)范化治療者；( 4 ) 生存時間＞5 年者；( 5 ) 發(fā)病治療后符合生育年齡 ( ＜40歲 ) 者。

2. 排除標(biāo)準(zhǔn)：( 1 ) 隨訪資料不全者；( 2 ) 不愿意接受相關(guān)咨詢和評價者；( 3 ) 不公開相關(guān)資料者。

二、一般資料

本研究共納入 35 例。具有生育要求的患者13 例，初診年齡 10～24 歲，平均年齡 18.5 歲；術(shù)后生存時間 7～21 年，平均術(shù)后生存時間 13.2 年；發(fā)病部位：股骨遠(yuǎn)端 8 例，脛骨近端 5 例；Enneking分期：均為 IIB 型；治療方式：活檢病理明確診斷后行術(shù)前化療、手術(shù)、術(shù)后化療，根據(jù)患者對化療藥物的耐受程度調(diào)整化療劑量及化療次數(shù)；化療藥物包括：順鉑 ( D )、多柔比星 ( A )、甲氨蝶呤 ( M )和異環(huán)磷酰胺 ( I )，具體化療方案[13-14]：MMIA 化療方案 8 例，MIDA 化療方案 1 例，DIA 化療方案4 例；手術(shù)方式：瘤段骨切除滅活再植術(shù) 7 例，瘤段骨切除特制腫瘤型人工假體置換術(shù) 6 例。

三、研究方法

電話隨訪 13 例具有生育要求的肢體骨肉瘤長期生存患者生育情況。查詢所接受化療方案，統(tǒng)計化療藥物累積量。

家庭隨訪肢體骨肉瘤長期生存患者生育子女，記錄年齡、身高、體重，計算體質(zhì)量指數(shù) ( BMI )，參考 WHO 2006 年公布 0～5 歲兒童生長標(biāo)準(zhǔn)，以及 2007 年美國國家營養(yǎng)調(diào)查數(shù)據(jù)為藍(lán)本所修訂的5～19 歲的生長標(biāo)準(zhǔn)評價身體發(fā)育速度[15]，營養(yǎng)狀況 ( 消瘦或超重 )[16-17]。

應(yīng)用量表評價患者子女智力發(fā)育情況：3 個月～3 歲患者子女應(yīng)用蓋塞爾智力量表[18]( 不包括3 歲 )；3～6 歲患者子女應(yīng)用韋氏幼兒智力量表[19]( 不包含 6 歲 )；6～16 歲患者子女應(yīng)用韋氏兒童智力量表[20]( 不包括 16 歲 )。

采集 6 例子女外周血液樣本送往深圳華大生物公司行染色體檢測。6 例患者子女及父母自愿接受基因檢測，均簽署自愿同意書，運用高通量測序技術(shù)進行全基因組測序 ( 染色體非整倍體、100Kb 以上缺失 / 重復(fù)檢測 )，其檢測結(jié)果參考基因組為 GRCh37 / hg，檢索數(shù)據(jù)庫包括 UCSC、DGV、OMIM、HGMD、DECIPHER、PubMed 和 ISCA 等。本次檢測尚無法檢測染色體高度重復(fù)、高度固縮區(qū)域 ( 如近著絲粒、端粒區(qū)域的染色體異常：羅氏易位等 )、多倍體變異、100Kb 以下缺失 / 重復(fù)、易位、倒位、低比例嵌合體、單親二倍體等情況。

本研究嚴(yán)格遵循我國倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，充分告知研究對象及家屬本次研究目的，嚴(yán)格保護研究對象及家屬的個人身份等隱私，在獲得研究對象及家屬許可且研究對象及家屬自愿簽署知情同意書的前提下進行研究。

結(jié) 果

一、13 例有生育要求的肢體骨肉瘤長期生存患者生育及接受化療藥物情況

通過電話隨訪得知 4 例未完成生育，2 例男性分別于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院診斷為無精癥和少精癥，1 例未孕女性化療結(jié)束后長期月經(jīng)不調(diào) ( 未對該患者配偶進行生殖功能評估 )，1 例男性患者妻子懷孕 42 周 ( 截至本次研究時間 )；初診年齡 10～19 歲，平均年齡16 歲；生存時間 6～17 年，平均生存時間 9.5 年；發(fā)病部位：股骨遠(yuǎn)端 3 例，脛骨近端 1 例；Enneking分期：均為 IIB 型；化療方案：MMIA 化療方案1 例，DIA 化療方案 2 例，MIDA 化療方案 1 例；接受化療累計藥物 ( 表1 )[21]：甲氨蝶呤 ( M )：0～80 g / m2，順鉑 ( D )：0～1320 mg / m2，異環(huán)磷酰胺( I )：10～110 g / m2，阿霉素 ( A )：90～990 mg /m2；手術(shù)方式：瘤段骨切除滅活再植術(shù) 1 例，瘤段骨切除特制腫瘤型人工假體置換術(shù) 3 例。

9 例完成生育，男 1 例，女 8 例；初診年齡14～24 歲，平均年齡 19.1 歲；生存時間 7～21 年，平均生存時間 13.7 年；發(fā)病部位：股骨遠(yuǎn)端 5 例，脛骨近端 4 例；Enneking 分期：均為 IIB 型；化療方案：MMIA 化療方案 7 例，DIA 化療方案 2 例；接受化療累計藥物 ( 表1 )：甲氨蝶呤 ( M )：0～180 g /m2，順鉑 ( D )：0～1440 mg / m2，異環(huán)磷酰胺 ( I )：10～120 g / m2，阿霉素 ( A )：90～1080 mg / m2；手術(shù)方式：瘤段骨切除滅活再植術(shù) 5 例，瘤段骨切除特制腫瘤型人工假體置換術(shù) 4 例。

表1 13 例有生育要求患者接受化療情況Tab.1 Chemotherapy for 11 patients with fertility wish

9 例共生育 12 名子女，男女比例 7∶5；1 例男性患者生育 2 名子女，8 例女性患者成功懷孕 9次，共生育 10 名子女 ( 1 例雙胞胎 )；年齡：10 個月～13 歲 4 個月，平均年齡 6 歲 1 個月；生產(chǎn)方式：順產(chǎn) 6 例，剖腹產(chǎn) 6 例；妊娠情況：無孕后流產(chǎn)，足月妊娠 11 例，早產(chǎn)兒 1 例，12 例子女均無出生缺陷，APGAR 評分均正常。

二、肢體骨肉瘤長期生存患者子女生長發(fā)育結(jié)果

9 例完成生育的長期生存肢體骨肉瘤患者及配偶均屬于中國漢族，排除不同種族間的生長發(fā)育差異。12 名肢體骨肉瘤長期生存患者子女生長發(fā)育情況見表2，年齡分布為 0～5 歲 5 例，6～19 歲7 例，所有兒童生長發(fā)育正常，無生長發(fā)育遲緩、低體重、超重。

三、肢體骨肉瘤長期生存患者子女智力發(fā)育結(jié)果

12 例子女智力發(fā)育結(jié)果 ( 表2 )，年齡＜3 歲共 5 名，應(yīng)用蓋塞爾智力量表評分分別為 89 分、96 分、94 分、95 分、94 分，測評為智力正常；年齡＞3歲＜6 歲共 1 名，應(yīng)用韋氏幼兒智力表評分 108 分，測評為智力正常；年齡＞6 歲＜16 歲共6 名，應(yīng)用韋氏兒童智力量表評分分別為：96 分、109 分、108 分、101 分、110 分、105 分，測評為智力正常。

表2 12 名子女生長發(fā)育及智力發(fā)育情況Tab.2 Growth and Intellectual Development of 11 Children

四、染色體檢測結(jié)果

6 例子女血液樣本均檢測成功，檢測結(jié)果見表3，對應(yīng)染色體核型分析 ( 圖1 )。6 例子女的染色體異常率 100%，結(jié)果重復(fù)率達(dá) 133%，缺失率達(dá)33.3%，6 例染色體重復(fù)或缺失片段區(qū)域內(nèi)相關(guān)基因在檢索數(shù)據(jù)庫 ( UCSC、DGV、OMIM、HGMD、DECIPHER、PubMed 和 ISCA 等 ) 中均未發(fā)現(xiàn)骨肉瘤及其它疾病的致病基因出現(xiàn)，未發(fā)現(xiàn)染色體非整倍體變異及已知的、致病性明確的 100Kb 以上的微缺失 / 微重復(fù)變異。

表3 染色體檢測結(jié)果Tab.3 Results of chromosome detection

圖1 6 例染色體核型分析Fig.1 Karyotype analysis of 6 cases

討 論

一、骨肉瘤長期生存患者子女健康狀況評價

兒童期和青春期是人體快速生長發(fā)育時期，遺傳因素是影響子女生長發(fā)育和智力發(fā)育的重要因素。骨肉瘤是兒童期和青春期最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤[22]。由于化療藥物及方案的不斷改進，兒童期和青春期肢體骨肉瘤患者得以長期生存，部分長期生存患者已生育子女[8-11]，但對肢體骨肉瘤患者子女健康狀況的隨訪尚無報道。本研究從身體發(fā)育和智力發(fā)育兩方面評價 12 名子女 ( 幼兒期 5 例，學(xué)齡前期 1 例，學(xué)齡期 5 例，青春期 1 例 ) 的健康狀況。11 名子女生長發(fā)育均正常，未發(fā)現(xiàn)發(fā)育遲緩或低體重事件；12 名子女智力發(fā)育評價均在正常水平，未發(fā)現(xiàn)智力發(fā)育障礙事件。接受規(guī)范化療的骨肉瘤長期生存患者子女兒童期和青春期未出現(xiàn)骨肉瘤病變或其它病變，健康狀況評價為正常。

二、染色體變異探討

目前骨肉瘤常用化療藥物 ( 甲氨蝶呤、順鉑、異環(huán)磷酰胺、阿霉素 ) 具有細(xì)胞毒性和遺傳毒性[23-26]，會對接受化療藥物治療的骨肉瘤患者 DNA 造成損傷，可能會誘導(dǎo)其它疾病的發(fā)生[27-28]。目前尚不明確肢體骨肉瘤患者接受化療藥物造成的 DNA 損傷是否會遺傳子女。25 歲以下患有骨肉瘤的患者中，約有20% 患者存在生殖系統(tǒng)基因改變[29]。骨肉瘤患者染色體具有高度非整倍性、不平衡性染色體重排的聚集、多區(qū)域的擴增與缺失在內(nèi)的基因組不穩(wěn)定性[30]，考慮長期生存的肢體骨肉瘤患者生育子女是否會遺傳骨肉瘤患者染色體不穩(wěn)定的特性。6 例染色體檢測結(jié)果都存在異常，重復(fù)率達(dá) 133%，缺失率達(dá) 33.3%，但在染色體重復(fù)或缺失區(qū)域內(nèi)未發(fā)現(xiàn)骨肉瘤或其它疾病致病基因出現(xiàn)，這種現(xiàn)象稱為染色體多態(tài)性[31]。傳統(tǒng)觀點認(rèn)為這種現(xiàn)象屬于正常變異，不引起表型異常，因而不具有臨床病理意義，但是近年來有報道不斷有證據(jù)表明染色體多態(tài)性改變與多種疾病的發(fā)生有關(guān)[32-37]。2007 年，王小榮等[38]對1414 例咨詢者血液樣本經(jīng) G、C 顯帶行核型分析，發(fā)現(xiàn)多態(tài)性變異 180 例，占 12.73%，既往文獻(xiàn)未報道正常人群運用本研究方法來進行畸變率統(tǒng)計。有研究認(rèn)為，細(xì)胞在冷、熱、缺氧等應(yīng)激狀態(tài)下，會發(fā)生致病性改變[39]。6 例子女均出現(xiàn)了染色體多態(tài)性改變，雖未有致病性基因出現(xiàn)，但可能在某種因素刺激下會表現(xiàn)出致病性，隨著研究的進一步深入可能會有更多的發(fā)現(xiàn)。長期生存的肢體骨肉瘤患者生育子女染色體雖未發(fā)現(xiàn)致病基因，但尚不能排除長期生存肢體骨肉瘤患者子女染色體對腫瘤的易感性增加。筆者推測長期生存肢體骨肉瘤患者子女染色體多態(tài)性改變與患者治療期間接受化療藥物治療密切相關(guān)，筆者嘗試證明某種化療藥物會造成相應(yīng)染色體片段的缺失或重復(fù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)每位患者子女染色體多態(tài)性改變都是獨立的，不具備共性，因而筆者進一步推測高劑量的化療藥物只會造成個體染色體片段重復(fù)或缺失幾率增加，而不會造成特定某個染色體片段的缺失或者重復(fù)。

三、化療藥物對肢體骨肉瘤長期生存患者生育能力及其生育子女健康影響探討

目前報道骨肉瘤患者生育子女文獻(xiàn)較少，既往文獻(xiàn)[8-11]累計報道 38 例肢體骨肉瘤長期生存患者共生育 54 名子女且出生子女無缺陷，其中 Longhi等[8]于 2000 年報道了 92 例女性骨肉瘤，22 例有生育要求的女性，20 例懷孕，2 例未能懷孕，14 例完成生育；25 例在化療結(jié)束后出現(xiàn)永久性不規(guī)則月經(jīng)周期，2 人永久性閉經(jīng)，研究結(jié)論稱化療對女性骨肉患者生育影響不大。2003 年該作者報道的 96 例男性骨肉瘤患者中 8 例患者共生育 12 名子女，26例未完成生育的男性患者接受精子質(zhì)量檢測，19 例患者 ( 中位隨訪時間為 6 年 ) 診斷為無精癥，1 例患者診斷為少精癥，文獻(xiàn)提到順鉑、阿霉素、甲氨蝶呤、異環(huán)磷酰胺四種化療藥物都會導(dǎo)致男性患者出現(xiàn)無精癥，其中異環(huán)磷酰胺化療藥物對男性不育風(fēng)險影響最大[9]。2004 年 Harish 等[11]報道 15 例有生育要求的患者均完成生育，共生育 22 名子女，研究結(jié)論稱化療不會影響肢體骨肉瘤患者生育。本研究報道了 13 例有生育要求，4 例未完成生育，9 例完成生育，共生育 12 名子女，出生子女均無缺陷。既往文獻(xiàn)未具體提及每例骨肉瘤患者接受化療藥物累積量，本研究 2 例未完成生育的男性患者均接受異環(huán)磷酰胺化療藥物累積量均超過 100 g / m2，順鉑化療藥物累計量均超過 1000 mg / m2，阿霉素藥物累積量均超過 900 mg / m2，生存時間均超過 7 年；1 例未孕女性患者僅接受了 2 次療程的 MMIA 化療，12 名子女在兒童期和青春期身體健康未見異常?；熕幬飳侨饬鲩L期生存患者造成的生殖功能損傷會逐步恢復(fù)，男性化療后出現(xiàn)無精癥一般在2～3 年內(nèi)是可逆的[40]，女性化療時出現(xiàn)閉經(jīng)一般在化療結(jié)束后月經(jīng)活動會再次開始[8]，但是接受高劑量化療藥物可能會造成骨肉瘤患者不能生育。從化療藥物對患者性腺損傷和生育影響角度來看，雖然我科與文獻(xiàn)報道藥物累積量均超出了藥物累計安全范圍[41-44]，但是大部分骨肉瘤患者都保留了生育能力，生育子女健康不受影響，只有少部分患者未能完成生育，這可能與患者自身性腺耐受程度和恢復(fù)能力有關(guān)。筆者可以推測化療藥物的應(yīng)用，會對長期生存骨肉瘤患者自身生育能力造成影響，但是不會對子女健康產(chǎn)生影響。

本研究發(fā)現(xiàn)規(guī)范化治療長期生存大部分骨肉瘤患者仍可正常生育子女，但少部分患者可能喪失生育能力，個體差異可能是影響患者生育的因素。肢體骨肉瘤長期生存患者的子女身體、智力均表現(xiàn)健康狀態(tài)，但染色體分析提示存在染色體片段的重復(fù)或缺失，發(fā)生原因和可能導(dǎo)致的后果不甚明確，筆者需要運用更精確的檢測技術(shù)去驗證。臨床工作中應(yīng)充分告知患者接受化療后的潛在風(fēng)險，包括不育風(fēng)險和生育后代存在染色體多態(tài)性改變的警告。

本研究存在不足之處，受多方面條件限制，研究樣本少，肢體骨肉瘤長期生存患者子女健康狀況未能充分反映，筆者在今后工作中，加強各骨腫瘤協(xié)作組之間的協(xié)作，進一步完善對骨肉瘤患者術(shù)后的隨訪工作，增加病例的積累，以求更客觀的反映肢體骨肉瘤長期生存患者子女健康狀況。