楊勇昆 黃真 丁宜 張文 徐海榮 劉巍峰 牛曉輝

骨巨細(xì)胞瘤雖然病理表現(xiàn)為良性骨腫瘤，但是局部侵襲性明顯，具有術(shù)后復(fù)發(fā)傾向，并影響患者肢體功能和生活質(zhì)量[1-2]。骨巨細(xì)胞瘤中的多核巨細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)、組織化學(xué)和骨吸收功能調(diào)控等方面與破骨細(xì)胞相似[3]，故又被稱為破骨細(xì)胞樣多核巨細(xì)胞。地舒單抗是一種新型人源化 RANKL 單克隆抗體，可特異性的與 RANKL 結(jié)合，從而阻斷 RANKLRANK 通路。該藥物可通過阻斷破骨細(xì)胞的分化而達(dá)到抑制骨破壞的作用[4]。近年來，地舒單抗逐漸應(yīng)用于骨巨細(xì)胞瘤的治療，特別是復(fù)發(fā)病例和難以通過手術(shù)切除的病例。地舒單抗治療可促進(jìn)病灶邊緣硬化、骨皮質(zhì)增厚和新生骨形成等[5-6]。一些臨床研究顯示[7-11]，術(shù)前用藥可以減小腫瘤體積，使腫瘤周邊硬化，更清楚的顯示出腫瘤范圍，從而將不可切除的腫瘤轉(zhuǎn)化為可以手術(shù)切除的腫瘤。

骨巨細(xì)胞瘤最好發(fā)于四肢長(zhǎng)管狀骨，但也有許多病例發(fā)生于骶骨和骨盆[12-13]。由于骨巨細(xì)胞瘤屬于良性骨腫瘤，大部分患者可接受刮除手術(shù)，同時(shí)由于腫瘤血運(yùn)十分豐富，術(shù)中出血量較大。特別是骶骨和骨盆部位的腫瘤，存在術(shù)中不能通過止血帶止血、局部解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜和手術(shù)時(shí)間長(zhǎng)等因素，這些因素可導(dǎo)致術(shù)中失血量大大增加，甚至危及患者生命[13-14]。因此，筆者通過本研究的主要目的是評(píng)價(jià)地舒單抗是否可以真正降低腫瘤血運(yùn)，從而減少術(shù)中失血。本研究從影像學(xué)和組織學(xué)兩方面的變化來評(píng)估骨巨細(xì)胞瘤接受地舒單抗治療前后的腫瘤血運(yùn)變化情況。

資料與方法

一、納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn)

1. 納入標(biāo)準(zhǔn)：( 1 ) 從 2014 年 6 月至 2017 年6 月，年齡 ≥ 12 歲或骨成熟者；( 2 ) 病理證實(shí)為骨巨細(xì)胞瘤者；( 3 ) 有可評(píng)價(jià)的骨病灶者；( 4 ) 藥物治療前病變部位手術(shù)治療困難或者不能進(jìn)行手術(shù)或有可能通過藥物治療將切除手術(shù)轉(zhuǎn)變?yōu)楸Ａ絷P(guān)節(jié)的刮除手術(shù)者；( 5 ) 藥物治療后接受最終手術(shù)治療者。

2. 排除標(biāo)準(zhǔn)：( 1 ) 評(píng)價(jià)部位接受過動(dòng)脈栓塞、放療等可能影響病灶血運(yùn)的治療者；( 2 ) 有下頜骨壞死或骨髓炎病史者；( 3 ) 孕婦；( 4 ) 拒絕入組本研究者。

本研究共納入 22 例，男 12 例，女 10 例。所有患者均有完整的用藥前后影像學(xué)和組織學(xué)資料?；颊咂骄挲g 32.1 ( 18～48 ) 歲。病灶部位如下：骶骨9 例，橈骨 4 例，脛骨 2 例，肱骨 2 例，髂骨、坐骨、尺骨、股骨和腓骨各 1 例。

二、研究和評(píng)價(jià)方法

1. 用藥方案：患者每 4 周接受一次地舒單抗120 mg 治療，在首次治療的第 8 天和第 15 天各增加一次用藥。用藥前患者在我院接受骨病灶部位增強(qiáng)CT 檢查，地舒單抗治療后 3 個(gè)月在同一臺(tái) CT 再次接受增強(qiáng) CT 檢查，兩次 CT 檢查的注射造影劑的劑量和掃描時(shí)間一致。用藥后 3 個(gè)月對(duì)腫瘤進(jìn)行影像學(xué)評(píng)價(jià)，如用藥前不可切除的病灶通過藥物治療轉(zhuǎn)變?yōu)榭墒中g(shù)的切除病灶或用藥前不可保留關(guān)節(jié)的病灶，藥物治療后轉(zhuǎn)變?yōu)榭赏ㄟ^保留關(guān)節(jié)的刮除手術(shù)治療的病灶，則停止用藥，患者接受最終手術(shù)。如未達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)，則繼續(xù)用藥后 3 個(gè)月再評(píng)價(jià)。本研究中全部患者均接受最終手術(shù)治療，術(shù)前平均接受地舒單抗治療 5 個(gè)月 ( 中位 4，范圍 3～12 )。

2. 影像學(xué)測(cè)量：測(cè)量時(shí)根據(jù)腫瘤大小在 CT 中選取 4～8 個(gè)層面，每個(gè)層面分別選取腫瘤區(qū)域測(cè)量，先將明顯囊性變、硬化或骨性分隔的區(qū)域排除，對(duì)剩余的腫瘤區(qū)域進(jìn)行測(cè)量。用藥前后分別測(cè)量病變相同層面的相同區(qū)域的 CT 值，并測(cè)量相同層面的主要血管 CT 值。CT 強(qiáng)化率＝增強(qiáng) CT 值 / 平掃CT 值。以血管強(qiáng)化率為參照，如用藥前后血管強(qiáng)化率無顯著差異，則用藥前后的 CT 檢查具有一致性和可比性。

3. 微血管密度檢測(cè)：微血管密度的計(jì)數(shù)應(yīng)由兩位病理醫(yī)師分別進(jìn)行。對(duì)藥物治療前的穿刺標(biāo)本和治療后的術(shù)后標(biāo)本，分別進(jìn)行免疫組化染色和微血管密度 ( MVD ) 測(cè)量。通過 CD34 抗體的免疫組化染色顯示病灶內(nèi)微血管[15-16]。首先在低倍鏡 ( 40×、100× ) 下瀏覽整張 HE 切片，尋找腫瘤范圍內(nèi)血管密度最高的區(qū)域，即熱點(diǎn)區(qū)，將這些區(qū)域作為免疫組化標(biāo)記計(jì)數(shù)血管的區(qū)域，然后于高倍鏡 ( 200× )下進(jìn)行微血管的計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)時(shí)，任何被臨近血管、腫瘤細(xì)胞或者結(jié)締組織所分隔的呈陽性染色的血管內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞團(tuán)都計(jì)數(shù)為一個(gè)單獨(dú)的血管，即使這些血管可能是臨近血管的不同斷面，也單獨(dú)計(jì)數(shù)。最后對(duì)多個(gè)高倍視野下的血管密度取平均值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)軟件 SPSS 20.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)算用藥前后平掃和強(qiáng)化 CT 的平均值以及 CT 強(qiáng)化率；計(jì)算用藥前后病灶微血管密度的平均值；采用均值t檢驗(yàn)比較用藥前后 CT 值、強(qiáng)化率和微血管密度的變化情況。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、血管強(qiáng)化率

用藥前血管平掃 CT 值平均為 44.2 ( 38～52 )，血管強(qiáng)化 CT 值平均為 136.8 ( 94～173 )；用藥后血管平掃 CT 值平均為 43.6 ( 35～55 )，血管強(qiáng)化 CT 值平均為 137.7 ( 93～165 )；血管用藥前和用藥后的平均強(qiáng)化率分別為 3.10 ( 1.90～4.59 ) 和 3.16 ( 1.92～4.72 )，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＝0.862，t＝0.136 )，說明用藥前后的 CT 值具有可比性 ( 表1 )。

表1 血管與病灶用藥前后強(qiáng)化率比較Tab.1 Comparison of enhancement rates of vessels and lesions before and after medication

二、病灶強(qiáng)化率比較

用藥前病灶平掃 CT 值平均為 46.2 ( 33～68 )，病灶強(qiáng)化 CT 值平均為 93.1 ( 50～150 )；用藥后病灶平掃 CT 值平均為 86.8 ( 38～357 )，病灶強(qiáng)化 CT值平均為 124.2 ( 39～380 )；病灶用藥前和用藥后的平均強(qiáng)化率分別為 2.01 ( 1.22～4.16 ) 和 1.43 ( 1.03～2.31 )，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＝0.000，t＝18.325 )，用藥后的病灶 CT 強(qiáng)化率顯著降低 ( 表1 )。

三、病灶平掃 CT 值比較

用藥前平均值為 46.2，用藥后平均值為 86.8，用藥后病灶平掃 CT 值顯著升高 (P＝0.032，t＝5.255 )。說明腫瘤的組織構(gòu)成發(fā)生變化，新生骨形成顯著增加，組織硬化明顯。

四、骶骨或骨盆與四肢骨病灶的病灶強(qiáng)化率比較

骶骨或骨盆病例用藥前后病灶平均強(qiáng)化率分別為 2.43 和 1.58，用藥后病灶強(qiáng)化率降低至用藥前的65.0%，顯著降低 (P＝0.001，F(xiàn)＝15.657 )。四肢骨病例用藥前后病灶平均強(qiáng)化率分別為 1.60 和 1.28，用藥后病灶強(qiáng)化率降低至用藥前的 80.0%，顯著降低 (P＝0.044，F(xiàn)＝4.125 )。骶骨或骨盆病例用藥后CT 強(qiáng)化率降低較四肢骨病例更為顯著 (P＝0.012，F(xiàn)＝8.665 ) ( 表2 )。

表2 骶骨或骨盆病例與四肢骨病例用藥前后強(qiáng)化率比較Tab.2 Comparison of enhancement rates of sacral or pelvic cases and limb cases before and after medication

五、組織學(xué)和微血管密度變化

藥物治療后的術(shù)后大體標(biāo)本顯示標(biāo)本組織硬化程度顯著增加，周邊硬化明顯，病灶內(nèi)新生骨和骨性分隔增加，腫瘤組織呈現(xiàn)出質(zhì)地堅(jiān)韌甚至堅(jiān)硬如骨質(zhì)的狀態(tài)，明顯不同于骨巨細(xì)胞瘤的典型表現(xiàn)。藥物治療前后的病灶內(nèi)微血管密度平均值分別為224.4 ( 68～324 ) 和 106.8 ( 21～197 )，治療后的微血管密度顯著降低 (P＝0.000，F(xiàn)＝42.437 ) ( 圖1 )。藥物治療后的組織學(xué)檢查顯示破骨細(xì)胞樣多核巨細(xì)胞幾乎消失，單核基質(zhì)細(xì)胞明顯減少 ( 圖2 )。

圖1 用藥前的穿刺腫瘤組織 ( a ) 顯示典型的骨巨細(xì)胞瘤的組織學(xué)特征，密集的單核基質(zhì)細(xì)胞中夾雜大量的多核巨細(xì)胞；用藥后的術(shù)后腫瘤組織 ( b ) 顯示破骨細(xì)胞樣多核巨細(xì)胞幾乎完全消失，單核細(xì)胞顯著減少Fig.1 Tumor biopsy tissues ( a ) before treatment showed typical histological features of bone giant cell tumors, with a large number of multinucleated giant cells mixed in dense mononuclear stromal cells.Postoperative tumor tissues ( b ) after treatment showed that osteoclast-like multinucleated giant cells almost disappeared and monocytes decreased significantly

圖2 藥物治療前后腫瘤組織免疫組化微血管染色。治療前的病灶 ( a ) 中可見大量的 CD34 抗體染色的微血管，治療后的病灶 ( b ) 中 CD34 抗體染色的微血管顯著減少F i g.2 I m m u n o h i s t o c h e m i c a l microvascular staining of tumor tissues before and after treatment. A large number of microvessels stained with CD34 antibody were observed in the lesions before treatment ( a ), and the microvessels stained with CD34 antibody decreased significantly in the lesions after treatment ( b )

六、術(shù)中情況

骶骨或骨盆病例的平均術(shù)中失血量和手術(shù)時(shí)間分別為 1883 ( 600～3000 ) ml 和 260 ( 180～390 ) min。四肢骨病例的平均術(shù)中失血量和手術(shù)時(shí)間分別為300 ( 30～800 ) ml 和 180 ( 120～270 ) min。

討 論

新型單克隆抗體藥物地舒單抗通過特異性的與 RANKL 結(jié)合，可以阻斷破骨細(xì)胞活化所需要的RANKL-RANK 通路，從而達(dá)到抑制破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨破壞的效果[4,17]。該藥物近年來逐步應(yīng)用于多種骨病和骨腫瘤的臨床治療，并在難治性或復(fù)發(fā)骨巨細(xì)胞瘤的治療中顯示出一定的積極效果。由于骨巨細(xì)胞瘤血運(yùn)豐富，特別是位于骶骨或骨盆等解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜、毗鄰重要血管和臟器的部位的腫瘤，術(shù)中失血和手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)較大[12-14]，如何在術(shù)前降低腫瘤血運(yùn)是值得研究的課題。本研究著眼于新型藥物地舒單抗在骨巨細(xì)胞瘤術(shù)前治療中的意義，評(píng)價(jià)和分析術(shù)前地舒單抗治療是否可以降低腫瘤血運(yùn)，從而為提高手術(shù)安全性提供幫助。

關(guān)于地舒單抗在骨巨細(xì)胞瘤治療中的臨床效果，既往臨床研究顯示，應(yīng)用地舒單抗治療骨巨細(xì)胞瘤，可以使患者臨床獲益，緩解臨床癥狀。一項(xiàng)2 期臨床試驗(yàn)[5]顯示，將地舒單抗用于 35 例不可切除或復(fù)發(fā)骨巨細(xì)胞瘤的治療，經(jīng)過平均 25 周的治療后，86% 的病例達(dá)到顯著的療效和臨床獲益，包括疼痛緩解和功能改善。該研究還證實(shí)了地舒單抗在骨巨細(xì)胞瘤中具有顯著地抑制破骨細(xì)胞形成和活性的作用。Dubory 等[18]報(bào)道脊柱骨巨細(xì)胞瘤接受地舒單抗 6 個(gè)月治療后，患者的疼痛和神經(jīng)癥狀有明顯緩解，臨床獲益顯著。

當(dāng)骨巨細(xì)胞瘤導(dǎo)致的骨破壞范圍較大且伴有巨大的軟組織包塊時(shí)，尤其是位于骶骨或骨盆的腫瘤，手術(shù)治療非常困難。術(shù)中失血量往往較大，而術(shù)中失血不僅增加患者的圍手術(shù)期風(fēng)險(xiǎn)，還會(huì)嚴(yán)重干擾術(shù)中視野和術(shù)者的操作，增加其它并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)和獲得安全的外科邊界的難度。如果腫瘤血運(yùn)和術(shù)中失血可以得到降低，手術(shù)操作將會(huì)更加從容和安全。研究顯示[19-20]，病灶部位的 CT 強(qiáng)化率可以反映腫瘤的血運(yùn)豐富程度。本研究為了提高 CT 檢查結(jié)果的一致性，用藥前后均在同一臺(tái) CT 儀器進(jìn)行檢測(cè)。用藥前后測(cè)量 CT 值時(shí)選擇相同層面的相同病灶區(qū)域。結(jié)果顯示用藥前后的血管強(qiáng)化率相似，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這提示用藥前后 CT 的檢查和測(cè)量值具有一致性和可比性，說明本研究方法的科學(xué)性。

本研究結(jié)果顯示地舒單抗治療后腫瘤的 CT 強(qiáng)化率顯著降低，這提示了腫瘤血運(yùn)的顯著降低。同時(shí)筆者還對(duì)用藥前后的腫瘤標(biāo)本進(jìn)行了微血管密度的染色和測(cè)算，并得到了相似的結(jié)果，藥物治療后的微血管密度有顯著降低。因此，本研究從影像學(xué)和組織學(xué)兩方面證實(shí)了地舒單抗治療可以降低骨巨細(xì)胞瘤的腫瘤血運(yùn)情況。組織學(xué)結(jié)果還顯示，藥物治療后破骨細(xì)胞樣多核巨細(xì)胞幾乎完全消失，這與既往的研究報(bào)道結(jié)果相似[9,17,21]。關(guān)于藥物治療降低腫瘤血運(yùn)的相關(guān)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究，這一現(xiàn)象是否與多核巨細(xì)胞的消失和腫瘤基質(zhì)細(xì)胞的顯著減少相關(guān)，值得今后開展更深入的研究。

筆者通過對(duì)本研究數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析還發(fā)現(xiàn)，骶骨或骨盆病例的腫瘤 CT 強(qiáng)化率降低更為明顯。本組病例中骶骨或骨盆病例的術(shù)中失血量平均為 1883( 600～3000 ) ml，病灶內(nèi)的出血速度和出血量相對(duì)于沒有接受地舒單抗治療的病例有顯著減少，同時(shí)腫瘤的硬化程度有顯著增加。因此，術(shù)前應(yīng)用地舒單抗在骶骨或骨盆病例中具有更好的減少術(shù)中失血的效果。

本研究的組織學(xué)結(jié)果顯示藥物治療后破骨細(xì)胞樣巨細(xì)胞幾乎消失和單核細(xì)胞的顯著減少。Branstette 等[9]報(bào)道一項(xiàng)將地舒單抗用于復(fù)發(fā)或不可手術(shù)切除的骨巨細(xì)胞的 2 期臨床試驗(yàn)顯示相似的組織學(xué)變化結(jié)果，用藥后破骨細(xì)胞樣巨細(xì)胞數(shù)量減少90% 以上，而腫瘤基質(zhì)細(xì)胞也有顯著減少。Isabella等[21]報(bào)道經(jīng)過 6 個(gè)月的地舒單抗治療后，呈現(xiàn)顯著的影像學(xué)和組織學(xué)變化，多核巨細(xì)胞和 RANKL 表達(dá)幾乎完全消失，影像學(xué)檢查顯示皮質(zhì)骨顯著增厚和新生骨顯著增加，使得一些病例可以接受腫瘤刮除而非切除。

用藥后病灶平掃 CT 值的顯著提高提示病灶硬化程度的增加，影像學(xué)上病灶變化非常顯著，本研究顯示的這一結(jié)果與既往一些研究報(bào)道結(jié)果[5-6,9,21-22]相似。這些硬化和新生骨增加可以使腫瘤的邊界更為清晰，從而使腫瘤的整塊切除更為容易操作，但同時(shí)會(huì)增加刮除的難度，尤其是骶骨腫瘤的刮除。盡管新生或增厚的骨鞘允許術(shù)者在這個(gè)硬化的邊界內(nèi)進(jìn)行刮除，但硬化的骨鞘中很可能包含有腫瘤細(xì)胞，并會(huì)成為術(shù)后復(fù)發(fā)的源頭和風(fēng)險(xiǎn)。Mak 等[23]報(bào)道當(dāng)應(yīng)用地舒單抗治療時(shí)，腫瘤基質(zhì)細(xì)胞處于休眠狀態(tài)，而一旦停藥，這些細(xì)胞就會(huì)恢復(fù)增殖和活性。一項(xiàng)最新的系統(tǒng)回顧性研究[24]對(duì) 686 例行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果顯示術(shù)前應(yīng)用地舒單抗雖然可以通過抑制破骨細(xì)胞來縮小腫瘤體積，但并不能有效降低術(shù)后復(fù)發(fā)。

綜上所述，本研究提示骨巨細(xì)胞瘤接受地舒單抗治療后，腫瘤的 CT 強(qiáng)化率和術(shù)后標(biāo)本的微血管密度顯著降低，術(shù)前應(yīng)用地舒單抗治療可顯著降低骨巨細(xì)胞瘤的腫瘤血運(yùn)。降低腫瘤血運(yùn)的相關(guān)機(jī)制以及該藥物對(duì)患者預(yù)后的影響有待進(jìn)一步的深入研究。