陳靖欣　梁梅娟　蘇佩冰　殷歡

摘要? ? 為了解決微生物法檢測嬰幼兒配方奶粉中生物素含量常遇到的問題，重點關(guān)注了試驗過程中的標準曲線、培養(yǎng)基和接種液制備的操作細節(jié)。結(jié)果表明，采用該方法檢測奶粉中的生物素時，標準曲線相關(guān)系數(shù)（R2）可達0.999 8，有較大的提高;平行測試的RSD為0.75%～2.14%，加標試驗回收率在96.08%～98.25%之間，平均回收率為97.54%。通過本方法，優(yōu)化了菌種活化、菌懸液制備及標準溶液配制過程，提高了檢測效率和準確性。

關(guān)鍵詞? ? 游離生物素;微生物法;菌懸液;標準曲線

中圖分類號? ? TS207.3? ? ? ? 文獻標識碼? ? A

文章編號? ?1007-5739（2019）15-0224-02

Research? on? Microbiology? Detection? Method? for? Free? Biotin? in? Infant? Milk? Powder

CHEN Jing-xin? ? LIANG Mei-juan? ? SU Pei-bing? ? YIN Huan

（Food and Drug Inspection Institute of Zhongshan City，Zhongshan Guangdong 528400）

Abstract? ? In order to solve the problems of microbiological detection for biotin content in infant milk powder，these steps were focused，including the details of standard curve，the preparation of medium and inoculant.Results showed that using this method，the correlation coefficient of the standard curve was 0.999 8，RSD of parallel tests was between 0.75% and 2.14%，and the recovery rate of standard addition experiment was between 96.08% and 98.25%，the average recovery was 97.54%.Through this method，the process of strain activation，suspension preparation and standard solution preparation was optimized，and the detection efficiency and accuracy were improved.

Key words? ? free biotin;microbiological method;bacterium suspension;standard curve

生物素是一種維持人體自然生長、發(fā)育和正常人體機能健康的必要營養(yǎng)素。目前，測定嬰幼兒奶粉中生物素的主要方法有高效液相色譜法[1]、微生物法[2-7]、微孔板試劑盒法[8-10]。其中，微生物法實際操作時總會遇到不少問題，例如測試管培養(yǎng)后吸光值不成梯度或測試菌不生長，測試樣濃度不落在標準曲線范圍內(nèi)，接種液的配制操作復(fù)雜且不知如何防止微生物交叉污染等，再加上菌種活化周期長、樣品處理復(fù)雜顯著加大了生物素的檢驗難度。針對此類問題，本文對菌種活化、菌懸液制備及標準溶液配制方面進行了研究，以期為提升測定效果提供參考。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 試驗材料

試驗材料包括生物素標準品（德國Dr.Ehrenstorfer）、菌種ATCC 8014植物乳桿菌、乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基（BD）、乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基（BD）和生物素測定用培養(yǎng)基（BD）。

供試儀器有雙光速紫外可見分光光度計（安捷倫Cary 60 UV-Vis）、低溫生化培養(yǎng)箱（BINDE KB400）、生物安全柜（美國BAKER）、鼓風(fēng)干燥箱（BINDE FD115）、高壓滅菌鍋（Hirayama）。

本試驗所用玻璃器皿均為此項目專用，不能與其他項目混用。玻璃儀器使用前，至少用酸浸泡12 h，后用純水沖洗，晾干后置于250 ℃干燥箱干熱2 h以上。培養(yǎng)用的試管建議用透氣硅塞，不建議使用螺旋密封蓋。

1.2? ? 試驗方法

1.2.1? ? 標準溶液的制備。準確稱取生物素標準品101.41 mg定容至1 000 mL，配制成濃度為101.41 μg/mL的標準儲備液，可存于2～4 ℃條件下12個月。吸取1 mL標準儲備液定容至100 mL，配制成濃度為1.014 1 μg/mL的標準中間液，可存于2～4 ℃條件下6個月。吸取標準儲備液將其稀釋成0.208 2 ng/mL高濃度標準溶液和0.104 1 ng/mL低濃度標準溶液，臨用前現(xiàn)配。上述溶液的配制均用50%乙醇溶液作介質(zhì)，容器選用棕色容量瓶。

1.2.2? ? 菌種活化和種子液的制備。①菌種活化對菌種活性的影響。試驗發(fā)現(xiàn)，將植物乳桿菌直接轉(zhuǎn)接到乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)液中活化，比轉(zhuǎn)接到乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基中活化再轉(zhuǎn)種到乳酸桿菌肉湯中的活力要好。因此，將凍存菌株直接接種到乳酸桿菌肉湯中（36±1）℃培養(yǎng)過夜。再轉(zhuǎn)接一代來增強活力，獲得足夠濃的乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)液即可開始配制接種液。②接種液濃度對結(jié)果的影響。接種液濃度太低會造成測試管耗盡生物素的時間變長，而接種液濃度太高又會造成測試管生長量過大。透光率在60%～80%之間時，透光率越低，標準系列管擬合值越好。因此，本文將透光率控制在60%～65%之間。③接種液的制備方法及注意事項。接種液若有雜菌污染，會使所有測試管菌都生長，最終沒有梯度。為了避免污染，提高制備接種液的效率，應(yīng)準備多支已滅菌的1.5 mL小型離心管，每支分裝1 mL菌液，在2 000 r/min條件下離心2～3 min，傾出上清液，加1 mL已滅菌NaCl溶液，混勻，再離心2～3 min，重復(fù)清洗3～4次，再加入1 mL NaCl混勻。將清洗后的菌液按一定體積添加到10 mL NaCl溶液中，分別為0.1、0.2、0.3 mL……混勻，用分光光度計以氯化鈉溶液作空白，于550 nm波長下測定菌懸液的透光率。需要注意的是，每次測菌懸液透光率前都需旋渦混勻，保證菌懸液的均勻性、透光率的準確性。當(dāng)獲得適當(dāng)透光率時，就按此比例重新配制接種液備用，避免因測定透光率而受到污染或備用接種液不夠的問題。接種液需在接種前1 h內(nèi)制備完成。

1.2.3? ? 樣品處理。樣品處理參照GB 5009.259—2016中6.2.2，根據(jù)樣品中生物素的含量確定稀釋倍數(shù)，確保樣品提取液稀釋后濃度落在標準曲線范圍內(nèi)。

1.2.4? ? 標準曲線的制備。取試管S1～S10分別加入低濃度標準溶液0（未接種空白）、0（接種空白）、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL和高濃度標準溶液3.0、4.0、5.0 mL，補水至5.0 mL，相當(dāng)于標準系列管中生物素含量為0、0、0.101、0.203、0.304、0.406、0.507、0.608、0.811、1.010 ng。加5.0 mL生物素測定用培養(yǎng)液，每梯度做3個平行樣。

1.2.5? ? 待測液的制備。取4支試管，分別加入1.0、2.0、3.0、4.0 mL試樣提取液，補水至5.0 mL，加入5.0 mL生物素測定用培養(yǎng)液，混勻，每個梯度做3個平行。先預(yù)估樣品中維生素含量，可根據(jù)樣品中維生素含量適當(dāng)調(diào)整樣品溶液和水的比例，建議使最低濃度測試管的濃度盡量落在標準曲線S3～S4的濃度之間。

1.2.6? ? 生物素測定用培養(yǎng)基的配制及接種。①生物素測定用培養(yǎng)基的配制。試驗發(fā)現(xiàn)，生物素測定用培養(yǎng)基配制過程中如果過度加熱會造成培養(yǎng)基失效，最終導(dǎo)致所有測試管的測試菌均不生長。因此，生物素測定用培養(yǎng)基在滅菌前加熱溶解的時間不能太久，加熱時需不斷攪拌，加熱至粉末剛?cè)芙馔昙赐Ｖ辜訜?。然后?21 ℃下滅菌5 min，滅菌完畢必須馬上從高壓鍋中取出，并放進冰水浴中及時冷卻，正常的培養(yǎng)基顏色應(yīng)為淺黃色。如果加熱后或滅菌后培養(yǎng)基顏色變深，均不能使用，需重新配制。②接種與培養(yǎng)。用移液槍向上述每個測管加入50 μL接種液，其中未接種空白S1和樣品空白除外。將上述所有管一同放入培養(yǎng)箱內(nèi)，在（36±1）℃溫度條件下培養(yǎng)20～24 h，可適當(dāng)延續(xù)培養(yǎng)時間，直至生物素消耗盡為止。培養(yǎng)后，S1、S2、S10和樣品空白管均要求不生長，試驗方有效。

1.2.7? ? 待測液濃度結(jié)果計算。依據(jù)每個測試管的吸光值，從標準曲線上找到相應(yīng)的生物素濃度，再計算每根測試管的生物素含量，取4個試管生物素含量的平均值作為最終結(jié)果。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? 生物素標準曲線

本法測定生物素的線性范圍為0.101～1.010 ng/100 g，其標準曲線（圖1）相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8。平行測試的RSD為0.1%～4.5%。

2.2? ? 方法的重復(fù)性

選取2種嬰幼兒奶粉作試驗材料，分別稱取了6個平行樣進行平行試驗，結(jié)果見表1?？梢钥闯?，6次平行試驗的相對標準偏差（RSD）在0.75%～2.14%之間，說明本方法的重復(fù)性良好。

2.3? ? 回收率試驗

稱取6份已知生物素含量的1號樣品作為基質(zhì)，分別添加低、中、高3個濃度生物素標準品各2組進行加標回收試驗，結(jié)果見表2?？梢钥闯觯摲椒ɑ厥章试?6.08%～98.25%之間，回收效果良好。

3? ? 結(jié)論與討論

從試驗驗證結(jié)果得出，通過優(yōu)化菌種活化步驟，提高了菌種的活性。該方法重復(fù)性和回收效果良好，同時，因重點關(guān)注標準溶液配制和培養(yǎng)基配制過程中的注意事項，防止了測試管生長不好、培養(yǎng)基失效、菌懸液配制時交叉污染和標準曲線線性不理想等問題，對微生物法測定生物素效果也有很大的提高。

4? ? 參考文獻

[1] 尹爍，楊懿，李永新，等.高效液相色譜法同時測定乳制品中的泛酸和生物素[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2018，45（4）：708-711.

[2] 食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中游離生物素的測定：GB 5413.19-2010[S/OL].[2019-02-20].http：//www.doc88.com/p-98836745 79016.html.

[3] 食品安全國家標準 食品中生物素的測定：GB 5009.259-2016[S/OL].[2019-02-20].http：//www.doc88.com/p-6791343561818.html.

[4] 秦磊磊，陳緒華，劉健，等.微生物法測定嬰幼兒奶粉中游離生物素條件優(yōu)化[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2013（15）：296-297.

[5] 聶炎炎，劉冬虹，吳環(huán)，等.嬰幼兒配方奶粉中生物素含量的快速微生物檢測方法研究[J].檢驗檢疫學(xué)刊，2014，24（6）：36-38.

[6] 劉亞兵，王俊平，劉正，等.嬰幼兒配方奶粉中生物素的測定與研究[J].農(nóng)業(yè)科技與信息，2018（23）：49-51.

[7] 徐瓊，王志偉，陳欣欽，等.微生物法測定嬰幼兒配方乳粉中的生物素、葉酸和V■[J].乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)，2014，37（6）：15-17.

[8] 程敏，劉錦光.傳統(tǒng)微生物法與試劑盒法測定乳粉中生物素比較[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2019，10（4）：988-991.

[9] 王晶，張攀，李玲，等.微孔板式微生物法檢測嬰幼兒配方乳粉中生物素含量方法研究[J].食品科技，2018，43（11）：346-348.

[10] 周敏，許再元，蘇水嬌，等.微孔板試劑盒法測定嬰幼兒配方奶粉中的生物素含量[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58（12）：2246-2248.