劉麗霞 張 麗,* 歐陽(yáng)霞輝 喬自林 付保強(qiáng)

(1 西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030； 2 西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心，甘肅 蘭州 730030)

牛(Bostaurus)的主要相容性復(fù)合體即牛的白細(xì)胞抗原(bovine lymphocyte antigen, BoLA)是一組緊密連鎖的高度多態(tài)基因家族，編碼主要組織相容性抗原，與機(jī)體的免疫應(yīng)答和抗病性具有密切的相關(guān)性，位于牛的第23號(hào)染色體上，由Ⅰ類(lèi)、Ⅱ類(lèi)和Ⅲ類(lèi)基因構(gòu)成[1-3]。牛DRA基因位于BoLA-Ⅱ類(lèi)基因的Ⅱa亞區(qū)，編碼DR分子的α鏈，參與抗原呈遞和傳輸過(guò)程[4]，與人DRA基因的結(jié)構(gòu)非常相似[5]，牛的DRA基因可在牛晚期黃體的內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)[6]。與α鏈上的其他基因相比，DRA基因的多態(tài)性較低[7]，早期研究認(rèn)為該基因僅有1個(gè)等位基因，是1個(gè)單態(tài)基因。隨后研究者發(fā)現(xiàn)牛的DRA基因座位上也存在等位變異，Sigurdardottir等[8]最早報(bào)道了5個(gè)DRA的RFLP分型；Sena等[9]發(fā)現(xiàn)水牛包含2個(gè)DRA等位基因，其中1個(gè)位于抗原結(jié)合位點(diǎn)上，且該基因在不同的品種中具有不同的特征；王興平[10]在秦川牛、魯西牛、南陽(yáng)牛和晉南牛的DRA外顯子2的第116和第197位分別發(fā)現(xiàn)G→A和T→C的點(diǎn)突變，且該基因?qū)δ详?yáng)牛的體高標(biāo)記效應(yīng)顯著；中國(guó)荷斯坦牛、中國(guó)西門(mén)塔爾牛和三河牛中具有3個(gè)DRA外顯子2的等位基因，其基因型與乳房炎的易感性和抗性有關(guān)[11]；甘南牦牛和天祝白牦牛DRA外顯子2具有3個(gè)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)(single nucleotide polymorphism sites, SNPs)，具有較為保守的多態(tài)性[12]；而李彥清等[13]在天祝白牦牛、大通牦牛、甘南牦牛和普通牛的DRA第2外顯子上檢測(cè)到197位的T>C和116位的G>A突變；Sun等[14]發(fā)現(xiàn)大額牛及其雜交后代DRA基因的核苷酸和氨基酸序列與普通牛和牦牛的相似度達(dá)到99%；張周等[15]在大通牦牛和天祝白牦牛DRA外顯子上分別檢測(cè)到2個(gè)堿基突變位點(diǎn)；付保強(qiáng)等[16]發(fā)現(xiàn)荷斯坦牛DRA外顯子1上有1個(gè)堿基插入。由此可見(jiàn)，牛DRA基因具有一定的多態(tài)性，但這種多態(tài)性具有高度的保守性。

從分子水平上了解基因的基本結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能，可為研究其作為疾病相關(guān)候選基因奠定理論基礎(chǔ)。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外已有關(guān)于牛DRA基因特性和結(jié)構(gòu)功能的相關(guān)研究報(bào)道[17-21]，但有關(guān)荷斯坦牛DRA基因序列特征的相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究利用荷斯坦?；蚪MDNA混合池?cái)U(kuò)增并直接測(cè)序的方法對(duì)DRA基因編碼區(qū)(coding regions, CDS)進(jìn)行多態(tài)性分析，同時(shí)利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)DRA基因的理化特性及其編碼蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)，以期為荷斯坦牛的疾病相關(guān)基因篩選和抗病分子育種提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究從寧夏農(nóng)墾賀蘭山奶業(yè)有限公司采集303頭荷斯坦牛尾靜脈血液各10 mL，低溫保存，帶回實(shí)驗(yàn)室后立即-20℃冷凍保存。采用傳統(tǒng)的酚-氯仿抽提法[22]提取血液基因組DNA。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中牛的DRA基因序列(登錄號(hào)：AJ505000和M30120)，利用NCBI在線軟件Primer-BLAST設(shè)計(jì)DRA基因4對(duì)引物(表1)，分別擴(kuò)增4個(gè)外顯子序列和部分內(nèi)含子序列，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

表1 DRA基因引物信息表Table 1 DNA primers of DRA gene

1.2.2 基因組DNA混合池構(gòu)建和PCR擴(kuò)增 選取擴(kuò)增效果良好的荷斯坦牛DNA樣品237個(gè)，每50個(gè)樣品構(gòu)建1個(gè)DNA混合池，以混合池DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積20 μL，包括混合DNA 1 μL、2×PowerTaqPCR MasterMix(百泰克公司，北京)11 μL、上下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL、滅菌超純水7 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火(不同引物溫度詳見(jiàn)表1)30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物的擴(kuò)增效果。

1.2.3 序列測(cè)定與比對(duì)DRA基因4個(gè)外顯子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由江蘇金唯智生物科技有限公司進(jìn)行純化后雙向測(cè)序，采用Editseq軟件檢查測(cè)序峰圖，利用MEGA6.0軟件比對(duì)4個(gè)外顯子序列，并進(jìn)行拼接獲得DRA基因編碼區(qū)序列。

1.2.4 序列特征分析 對(duì)DRA基因編碼區(qū)序列特征進(jìn)行分析用到的工具包括：Expasy服務(wù)器上的ProtParam工具和Protscale程序；CBS的NetNGlyc和NetPhos在線軟件；PredictProtein服務(wù)器；SWISS-MODEL同源建模構(gòu)建蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)模型并繪制PyMOL軟件視圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 荷斯坦牛DRA基因4個(gè)外顯子擴(kuò)增結(jié)果

由圖1可知，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶特異性良好，條帶清晰，DRA基因4個(gè)外顯子片段大小均與預(yù)期擴(kuò)增片段相符。

注：M：DL 2 000 DNA maker；泳道1，2：DRA外顯子1； 泳道3，4：DRA外顯子2；泳道5，6：DRA外顯子3；泳道7，8：DRA外顯子4。Note: M:DL 2 000 DNA maker. Lane 1,2:DRA exon1. Lane 3,4: DRA exon2. Lane 5,6:DRA exon3. Lane 7,8: DRA exon4.圖1 荷斯坦牛DRA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 The PCR amplicons of DRA gene in Holstein cattle

注：方框內(nèi)為外顯子2序列。Note: The sequence of exon2 is showed in the box.圖2 荷斯坦牛DRA基因編碼區(qū)核苷酸序列與參考序列比對(duì)結(jié)果Fig.2 Alignment of the nucleotide sequences of DRA coding regions identified from Holstein cattle and reference sequence from Genbank

2.2 荷斯坦牛DRA基因編碼區(qū)序列比對(duì)

荷斯坦牛DRA基因CDS區(qū)序列全長(zhǎng)762 bp，與GenBank中牛的DRA基因序列(AJ505000和M30120)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)荷斯坦牛DRA基因CDS區(qū)共有4個(gè)堿基突變(圖2)，均位于外顯子2上，分別為 c.161A>T、c.195G>A、c.276C>T和c.312C>A，其中第161位的A>T突變?yōu)殄e(cuò)義突變，導(dǎo)致第54位氨基酸由谷氨酸(E)變?yōu)槔i氨酸(Ⅴ)，其余均為同義突變。

2.3 序列特征分析

2.3.1 荷斯坦牛DRA基因編碼氨基酸的理化特性和親/疏水性 利用ProtParam工具預(yù)測(cè)荷斯坦牛DRA基因編碼氨基酸的理化特性和組成，結(jié)果顯示，荷斯坦牛DRA基因共編碼253個(gè)氨基酸，氨基酸組成中亮氨酸比例最高，占所有氨基酸組成的10.30%，而半胱氨酸比例最低(1.20%)(表2、圖3)。采用Protscale程序預(yù)測(cè)荷斯坦牛DRA基因編碼氨基酸的親/疏水性，結(jié)果表明，多肽鏈的第227位疏水性最強(qiáng)，評(píng)分為3.43，第103位親水性最強(qiáng)，評(píng)分為-2.52(圖4)。整條氨基酸肽鏈的親水和疏水氨基酸分別占53.47%和46.53%，總平均親水性為0.09。

圖3 荷斯坦牛DRA基因編碼氨基酸組成預(yù)測(cè)Fig.3 Putative amino acid composition of DRA gene in Holstein cattle

注：正值表示疏水；負(fù)值表示親水。Note: Positive means hydrophobicity.Negative means hydropathicity.圖4 荷斯坦牛DRA基因編碼氨基酸的親水性/疏水性預(yù)測(cè)Fig.4 Prediction of hydropathicity/hydrophobicity of amino acids encoded by DRA gene in Holstein cattle

2.3.2 荷斯坦牛DRA基因編碼氨基酸的N-糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn) NetNGlyc和NetPhos在線軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，荷斯坦牛DRA基因編碼的氨基酸無(wú)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，有15個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)(表3)。

2.3.3 荷斯坦牛DRA蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu) PredictProtein預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，荷斯坦牛DRA蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)組分中α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲所占比例分別為18.97%、30.04%、7.51%和43.48%，其中無(wú)規(guī)則卷曲是荷斯坦牛DRA蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中的主要元件。利用SWISS-MODEL同源建模構(gòu)建DRA蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型并繪制PyMOL軟件視圖(圖5)。

表3 荷斯坦牛DRA基因編碼氨基酸的磷酸化位點(diǎn)Table 3 Phosphorylation sites of amino acids encoded by DRA gene in Holstein cattle

圖5 荷斯坦牛DRA蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型預(yù)測(cè)Fig.5 Tertiary structure of DRA protein for Holstein cattle

3 討論

MHC基因在抗原特異性適應(yīng)免疫反應(yīng)中起著重要作用[23]。牛的DRA基因編碼牛MHCⅡ類(lèi)抗原分子的α鏈，該基因外顯子2編碼的抗原結(jié)合區(qū)在抗原識(shí)別與呈遞中發(fā)揮著重要作用[24]。研究表明，豬DRA基因與腹瀉之間存在顯著的相關(guān)性[25-26]，牛DRA外顯子2與牛乳房炎的抗性和易感性有關(guān)[27-29]。因此，對(duì)動(dòng)物DRA基因多態(tài)性和結(jié)構(gòu)功能的研究是進(jìn)一步研究該基因作為動(dòng)物抗病相關(guān)候選基因可能性的基礎(chǔ)。

基因的多態(tài)性與動(dòng)物的生產(chǎn)性狀間存在一定的相關(guān)性[30]，對(duì)動(dòng)物基因多態(tài)性的研究是探究其與生產(chǎn)性能間關(guān)系的基礎(chǔ)。本研究中，荷斯坦牛DRA基因編碼區(qū)具有4個(gè)核苷酸突變位點(diǎn)，包含1個(gè)錯(cuò)義突變和3個(gè)同義突變，比其他品種牛的突變位點(diǎn)多，但c.195G>A和c.276C>T位點(diǎn)在各牛種中均存在[11-14]，表明荷斯坦牛DRA基因的多態(tài)性較為豐富，同時(shí)牛DRA基因在品種間表現(xiàn)出高度的保守性。

對(duì)基因特性的分析可揭示其在機(jī)體中可能發(fā)揮的作用[31]。荷斯坦牛DRA基因共編碼253個(gè)氨基酸，根據(jù)其理論等電點(diǎn)(<7)和不穩(wěn)定指數(shù)(<40)推斷，該蛋白為酸性且穩(wěn)定蛋白[32]，胞內(nèi)蛋白的穩(wěn)定性直接影響著生命活動(dòng)和細(xì)胞周期。蛋白質(zhì)的疏水性對(duì)其穩(wěn)定性、構(gòu)象和功能具有一定的影響[33]，荷斯坦牛DRA蛋白總平均疏水性大于0，由此推斷荷斯坦牛DRA蛋白為不可溶蛋白，與南陽(yáng)牛一致，而與犏牛不同[34]。蛋白質(zhì)糖基化主要修飾天冬酰胺上的N端，影響免疫分子的結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)一步影響機(jī)體對(duì)抗原的應(yīng)答反應(yīng)[33,35]，而磷酸化可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用，從而對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化以及基因表達(dá)造成一定的影響[36]，荷斯坦牛DRA蛋白無(wú)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，而存在15個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，這表明DRA基因?qū)伤固古５目乖庖邞?yīng)答影響不大，但可能通過(guò)影響其他基因的表達(dá)、病毒的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或者細(xì)胞的代謝從而改變機(jī)體的抗病能力。

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)是指多肽鏈依賴(lài)氫鍵排列成具有周期性結(jié)構(gòu)的構(gòu)象，是氨基酸序列和三維構(gòu)象之間的橋梁，對(duì)其進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析有助于認(rèn)識(shí)蛋白的空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)而了解蛋白的功能[26]。荷斯坦牛DRA蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)為混合型(Hh<45%，Ee>20%)[37]，該蛋白中較大比例的無(wú)規(guī)卷曲(43.48%)可能影響蛋白質(zhì)肽鏈中配體和受體的結(jié)合，進(jìn)而影響生物學(xué)功能。

4 結(jié)論

本研究利用基因組DNA混合池?cái)U(kuò)增并直接測(cè)序的方法獲得荷斯坦牛DRA基因編碼區(qū)序列并對(duì)其特征進(jìn)行分析，結(jié)果表明，荷斯坦牛DRA基因編碼區(qū)上僅有4個(gè)堿基突變，多態(tài)性較低。荷斯坦牛DRA基因共編碼253個(gè)氨基酸，其編碼產(chǎn)物是一種酸性且穩(wěn)定的不可溶蛋白，具有15個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)；二級(jí)結(jié)構(gòu)為混合型，其中無(wú)規(guī)則卷曲所占的比例最高；三級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲組成。本研究結(jié)果為深入研究荷斯坦牛DRA基因分子結(jié)構(gòu)和功能奠定了一定的理論基礎(chǔ)。