金開銘，田 彬，盛玉珍，熊詠梅，徐 磊，張 玲，王 麗*

(1.喜德縣林業(yè)局，四川 喜德 616750；2.長江造林局攀枝花分局，四川 攀枝花 617000；3.四川省林業(yè)科學(xué)研究院,四川 成都 610081)

微生物肥料是一種帶有活菌體的輔助性肥料，通過微生物種群間的生命活動及其代謝產(chǎn)物的共同作用，直接或間接地分解、合成能促進(jìn)植物生長發(fā)育的物質(zhì)，增強抗逆性、抗病蟲性[1]。施用微生物肥料不僅可以增加營養(yǎng)物質(zhì)，還因其含有大量的有益微生物，施入土壤后，通過有益微生物的大量繁殖而發(fā)揮其固氮、磷鉀釋放、擴大根系吸收面積和抑制有害病菌繁殖的作用。目前，微生物菌肥的使用已越來越廣泛[2～8]，功能微生物菌群作為復(fù)合微生物肥料的核心部分，是微生物肥料生產(chǎn)中的關(guān)鍵技術(shù)。培養(yǎng)基配比及發(fā)酵條件對菌體生長的影響較大。胡秀芳[9]，楊鏗[10]等均開展微生物菌肥主要功能菌發(fā)酵技術(shù)研究，探究其最佳的發(fā)酵條件，為規(guī)模化生產(chǎn)微生物肥料提供科學(xué)指導(dǎo)。

微生物發(fā)酵的生產(chǎn)水平不僅取決于生產(chǎn)菌先天的特性，而且還需要合適的發(fā)酵條件，這樣才能使菌株的生產(chǎn)能力充分發(fā)揮出來。發(fā)酵條件的優(yōu)化是菌株應(yīng)用到實際生產(chǎn)中所經(jīng)歷的一個重要環(huán)節(jié)，直接關(guān)系到菌劑的質(zhì)量和生產(chǎn)效益[11]。本研究選取微生物肥料中的主要功能菌即固氮菌、溶磷菌和解鉀菌，利用單因素結(jié)合正交實驗方案，篩選最適合菌株發(fā)酵生長的培養(yǎng)基及其發(fā)酵條件，為以后的微生物肥料的開發(fā)奠定理論依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

實驗所用到的菌種固氮菌、溶磷菌、解鉀菌菌種購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院商城分院(BNCC)，菌種的詳細(xì)信息分別為：

固氮菌：褐球固氮菌，Azotobacter chroococcum，資源編號BNCC192292，其他編號=BN24，用于生產(chǎn)固氮菌肥料。

溶磷菌：巨大芽孢桿菌，Bacillus megaterium，資源編號BNCC190686，可用于生產(chǎn)解磷細(xì)菌肥料。

解鉀菌：膠凍樣芽孢桿菌，Bacillus mucilaginosus，資源編號BNCC195271，鉀細(xì)菌。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、蒸餾水 1 000 mL，pH 值7.2～7.4，121℃滅菌19 min。固體培養(yǎng)基另加瓊脂粉15 g。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：根據(jù)許凈凈等[17]的報道，基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基采用葡萄糖5g、蛋白胨10 g、NaH2PO4.H2O 0.3 g、K2HPO40.5 g、MnSO4.H2O 0.2 g、蒸餾水 1 000 mL，pH值7.2～7.4，113℃滅菌19 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的活化

將保存在-70℃的菌種接種于新鮮的LB固體培養(yǎng)基上，連續(xù)活化兩次，28℃恒溫培養(yǎng)18 h。取新鮮LB固體培養(yǎng)基一環(huán)菌種，接種于LB液體培養(yǎng)基中，往復(fù)式搖床150 r·min-1，28℃恒溫培養(yǎng)24h后備用。

1.2.2 生長曲線測定

采用比濁法測定菌體量：①將活化好的固氮菌、解磷菌、解鉀菌接種到50 mL的LB液體培養(yǎng)基中，以未接種的培養(yǎng)基作為空白對照；②將培養(yǎng)液置于恒溫?fù)u床上以180 r·min-1的轉(zhuǎn)速30℃振蕩培養(yǎng)；③用分光光度計，從0時開始，每隔5h于波長600 nm處測定培養(yǎng)液的OD值，每次測定時以空白對照調(diào)儀器零點，每次取樣2 mL；④以時間為橫坐標(biāo)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，制作曲線，即為細(xì)菌在該培養(yǎng)條件下的生長曲線。

1.2.3 培養(yǎng)基成分的篩選

(1)培養(yǎng)基碳源的優(yōu)化

分別以5 g淀粉、麥芽糖、蔗糖、甘露醇替換基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖，其他條件不變，250 mL三角瓶中裝液量為100 mL，每個三角瓶中接入5 mL的菌液，于30℃，150 r·min-1條件下?lián)u床培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的菌液測其OD600值。

(2)培養(yǎng)基氮源優(yōu)化

(3)培養(yǎng)基無機鹽優(yōu)化

采用以上單因子實驗得到的最優(yōu)碳源、最優(yōu)氮源代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源和氮源，無機鹽分別采用FeCl3、MgSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、ZnCl2，其他成分不變，方法同上。

(4)培養(yǎng)基優(yōu)化正交實驗

采用三因素三水平正交實驗表，使用單因子實驗所測定的最適碳源、氮源、無機鹽配制不同濃度的發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，見表1。250 mL三角瓶中裝液量為100 mL，每個三角瓶中接入1 mL的菌液，于30℃，150 r·min-1條件下?lián)u床培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的菌液測其OD600值。

表1正交實驗設(shè)計

Tab.1 Orthogonal experimental design

1.2.4 發(fā)酵條件優(yōu)化

建設(shè)學(xué)習(xí)小組的主要內(nèi)容由建設(shè)小組凝聚力、學(xué)習(xí)氛圍及合理安排成員分工三部分組成。小組凝聚力與學(xué)習(xí)氛圍的建設(shè)要靠教師長期引導(dǎo)，而合理安排成員分工則要靠學(xué)生自主摸索，根據(jù)組內(nèi)成員特長進(jìn)行安排。一般而言，需要組長監(jiān)督，語言能力強的學(xué)生進(jìn)行發(fā)言提問，思維活躍的學(xué)生進(jìn)行質(zhì)疑，還要有學(xué)生進(jìn)行知識總結(jié)等，但這些角色又是動態(tài)變化的，可以一人分飾多角。例如在學(xué)習(xí)《贈汪倫》一詩時，需要有學(xué)生發(fā)言提問，需要有古文功底深厚的學(xué)生進(jìn)行知識點歸納，需要學(xué)生舉一反三，還需要學(xué)生幫助組內(nèi)成員提高。不管如何分配角色，都要保證組內(nèi)成員有互幫互助精神，保證每位組內(nèi)成員都能共同進(jìn)步。

以優(yōu)化的碳源、氮源及無機鹽配制培養(yǎng)基，采用單因子試驗進(jìn)行最適pH、接種量、轉(zhuǎn)速和培養(yǎng)溫度優(yōu)化。初始pH設(shè)置為6.4、6.8、7.2、7.6和8，接種量設(shè)置為1%、2.5%、4%、5.5%和7% ，轉(zhuǎn)速設(shè)置為90 r·min-1、120 r·min-1、150 r·min-1、180 r·min-1和210 r·min-1，溫度設(shè)置為22℃、26℃、30℃、34℃和38℃其他條件不變，方法同上。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值，采用Microsoft Excel 2003軟件作圖。

2 實驗結(jié)果

2.1 生長曲線測定

通過測定OD600的吸光度值來反應(yīng)菌液的菌體濃度。對數(shù)期的菌體生長代謝較為旺盛，將對數(shù)生長期的菌體接入發(fā)酵培養(yǎng)基，能縮短發(fā)酵周期，提高設(shè)備的利用率。從圖1可知道，固氮菌在5 h左右進(jìn)入對數(shù)生長期，30 h左右進(jìn)入穩(wěn)定期，在25 h左右進(jìn)入對數(shù)生長末期，之后OD值變化不大，菌，體濃度達(dá)到最大，此時是菌株的最佳種齡。溶磷菌在2.5h左右進(jìn)入對數(shù)生長期，30 h左右進(jìn)入穩(wěn)定期，在22.5h左右進(jìn)入對數(shù)生長末期，之后OD值變化不大，菌體濃度達(dá)到最大，此時是菌株的最佳種齡。解鉀菌在5h左右進(jìn)入對數(shù)生長期，25h左右進(jìn)入穩(wěn)定期，在20h左右進(jìn)入對數(shù)生長末期，之后OD值變化不大，菌體濃度達(dá)到最大，是菌株的最佳種齡。

圖1 固氮菌、溶磷菌、解鉀菌生長曲線Fig．1 The growth curve of the nitrogen-fixing bacteria,the phosphate-solubilizing bacteria and the potassium-releasing bacteria

2.2 最佳培養(yǎng)基成分的確定

2.2.1 最佳碳源、氮源、無機鹽篩選

固氮菌最佳碳源、氮源、無機鹽篩選見表2，從表中可以看出，當(dāng)以麥芽糖為碳源時，菌液的濃度最大，其OD600為1.001，當(dāng)以甘露醇為碳源時，OD600為0.677，菌液濃度最小，因此最佳碳源為麥芽糖。在最佳氮源的篩選實驗中，當(dāng)以蛋白胨為唯一氮源時，發(fā)酵液濃度最大，OD600為0.873，當(dāng)以尿素為氮源時，OD600為-0.008，幾乎沒有發(fā)酵，故最佳氮源為蛋白胨。當(dāng)以麥芽糖為碳源，以蛋白胨為氮源時，添加無機鹽FeCl3和MgSO4·7H2O時發(fā)酵液的OD600分別為0.595和0.713，發(fā)酵效果較好，因此選擇無機鹽FeCl3和MgSO4·7H2O在正交實驗中進(jìn)行優(yōu)化。

表2固氮菌培養(yǎng)基添加不同碳源、氮源和無機鹽時發(fā)酵液OD600值

Tab.2 TheOD600ofthenitrogen-fixingbacteriaunderthedifferentCsource,theNsourceandtheinorganicsaltsource

碳源 OD600氮源 OD600無機鹽OD600葡萄糖0.832蛋白胨0.873淀粉0.851NH4NO30.065FeCl30.595麥芽糖1.001酵母浸膏0.829MgSO4·7H2O0.713蔗糖0.875尿素-0.008CuSO4·5H2O0.017甘露醇0.677牛肉膏0.753ZnCl20.015

溶磷菌最佳碳源、氮源、無機鹽篩選見表3，從表中可以看出，當(dāng)以麥芽糖為碳源時，菌液的濃度最大，其OD600為0.857，當(dāng)以甘露醇為碳源時，OD600為0.713，菌液濃度最小，因此最佳碳源為麥芽糖。在最佳氮源的篩選實驗中，當(dāng)以蛋白胨為唯一氮源時，發(fā)酵液濃度最大，OD600為0.814，當(dāng)以尿素為氮源時，OD600為0.023，幾乎沒有發(fā)酵，故最佳氮源為蛋白胨。當(dāng)以麥芽糖為碳源，以蛋白胨為氮源時，添加無機鹽FeCl3和MgSO4·7H2O時發(fā)酵液的OD600分別為0.557和0.665，發(fā)酵效果較好，因此選擇機鹽FeCl3和MgSO4·7H2O在正交實驗中進(jìn)行優(yōu)化。

表3溶磷菌培養(yǎng)基添加不同碳源、氮源和無機鹽時發(fā)酵液OD600值

Tab.3 TheOD600ofthephosphate-solubilizingbacteriaunderthedifferentCsource,theNsourceandtheinorganicsaltsource

碳源 OD600氮源 OD600無機鹽OD600葡萄糖0.753蛋白胨0.814淀粉0.792NH4NO30.141FeCl30.577麥芽糖0.857酵母浸膏0.729MgSO4·7H2O0.665蔗糖0.815尿素0.023CuSO4·5H2O0.009甘露醇0.713牛肉膏0.781ZnCl20.005

解鉀菌最佳碳源、氮源、無機鹽篩選見表4，從表中可以看出，當(dāng)以甘露醇為碳源時，菌液的濃度最大，其OD600為0.529，當(dāng)以蔗糖為碳源時，OD600為0.160，菌液濃度最小，因此最佳碳源為甘露醇。在最佳氮源的篩選實驗中，當(dāng)以牛肉膏為唯一氮源時，發(fā)酵液濃度最大，OD600為0.571，當(dāng)以尿素為氮源時，OD600為0.002，幾乎沒有發(fā)酵，故最佳氮源為牛肉膏。當(dāng)以為甘露醇碳源，以牛肉膏為氮源時，添加無機鹽FeCl3和MgSO4·7H2O時發(fā)酵液的OD600分別為0.327和0.250，因此選擇機鹽FeCl3和MgSO4·7H2O在正交實驗中進(jìn)行優(yōu)化。

表4解鉀菌培養(yǎng)基添加不同碳源、氮源和無機鹽時發(fā)酵液OD600值

Tab.4 TheOD600ofthepotassium-releasingbacteriaunderthedifferentCsource,theNsourceandtheinorganicsaltsource

碳源 OD600氮源 OD600無機鹽OD600葡萄糖0.268蛋白胨0.257淀粉0.179NH4NO30.045FeCl30.327麥芽糖0.182酵母浸膏0.375MgSO4·7H2O0.250蔗糖0.160尿素0.002CuSO4·5H2O0.033甘露醇0.529牛肉膏0.571ZnCl20.105

2.2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化正交實驗

實驗選取L934正交表，利用上文單因素篩選出來的最佳碳源(A)、氮源(B)、無機鹽(C和D)，每個實驗重復(fù)3次，結(jié)果見表5～7。

固氮菌培養(yǎng)基優(yōu)化的實驗結(jié)果見表5，極差R表示各因素對菌體生長影響的強弱，由表中可知，影響固氮菌發(fā)酵液中菌液濃度的因素依次為R蛋白胨>R麥芽糖>R FeCl3>MgSO4·7H2O。K表示同一因素間不同濃度對菌體生長的影響，K1水平1，K2表示水平2，K3表示水平3，從表中可以看出，發(fā)酵結(jié)果最優(yōu)的水平為A3B3C2D3，即葡萄糖濃度7.5g/L，蛋白胨濃度15 g·L-1，F(xiàn)eCl3濃度0.2 g·L-1，MgSO4·7H2O濃度為0.5 g·L-1時對菌體生長最為有利，此時最佳培養(yǎng)基的成分為麥芽糖7.5 g、蛋白胨15 g、NaH2PO4.H2O 0.3 g、K2HPO40.5 g、FeCl30.2 g、MgSO4·7H2O 0.5 g。

表5固氮菌培養(yǎng)基優(yōu)化正交實驗表

Tab.5 Orthogonalexperimentaldesignofthenitrogen-fixingbacteria

注：K為每個因素同水平之和； T為K的均值； R極差。

表6溶磷菌培養(yǎng)基優(yōu)化正交實驗表

Tab.6 Orthogonalexperimentaldesignofthephosphate-solubilizingbacteria

因素A麥芽糖/(g·L-1)B蛋白胨/(g·L-1)CFeCl3/(g·L-1)DMgSO4·7H2O(g·L-1)OD60012.550.10.10.42622.5100.20.20.46432.5150.50.50.6904550.20.50.65155100.50.10.71165150.10.20.74577.550.50.20.67687.5100.10.50.73197.5150.20.10.770K11.5801.7531.9021.907K22.1071.9061.8551.855K32.1772.2052.0772.072T10.5270.5840.6340.636T20.7020.6350.6180.618T30.7230.7350.6920.691R0.1960.1510.0740.073

注：K為每個因素同水平之和；T為K的均值；R極差。

表7解鉀菌培養(yǎng)基優(yōu)化正交實驗表

Tab.7 Orthogonalexperimentaldesignofthepotassium-releasingbacteria

因素A甘露醇/(g·L-1)B牛肉膏/(g·L-1)CFeCl3/(g·L-1)DMgSO4·7H2O/(g·L-1)OD60012.550.10.10.42622.5100.20.20.46432.5150.50.50.6904550.20.50.65155100.50.10.71165150.10.20.74577.550.50.20.67687.5100.10.50.73197.5150.20.10.770K10.9681.1091.2341.217K21.3691.1321.1941.324K31.5791.6931.5061.393T10.3230.3700.4110.406T20.4560.3770.3980.441T30.5260.5640.5020.464R0.2030.1940.1040.058

注：K為每個因素同水平之和； T為K的均值； R極差。

2.3 討論

2.3.1 初始pH優(yōu)化

從圖2可以看出不同初始pH條件對菌株的生長有一定影響。具體來說，pH對固氮菌菌體生長的影響范圍較寬，初始pH在6.8～8.0范圍內(nèi)，菌體均能較好生長。當(dāng)pH值為6.4～6.8時，固氮菌的生長量呈上升趨勢，當(dāng)pH值為6.8～8時，生長量隨著pH值的增大而減少，當(dāng)pH值為6.8時，發(fā)酵液的OD600為最大，達(dá)到1.085，因此固氮菌的最佳發(fā)酵pH值為6.8。

對于溶磷菌來說，隨著pH值得增大，菌體的生長量呈緩慢下降的趨勢，當(dāng)pH值為6.4時，菌體的生長量達(dá)到最大，因此溶磷菌的最佳發(fā)酵PH值為6.4。

對于解鉀菌來說，隨著pH值得上升，菌體生長量呈緩慢上升的趨勢，之后隨著pH的繼續(xù)增大，菌體的生長量迅速下降，說明發(fā)酵液的pH過高不利于解鉀菌的生長，當(dāng)pH為7.6時菌體的生長量達(dá)到最大，因此解鉀菌的最佳發(fā)酵pH值為7.6。

圖2 不同pH值對菌株發(fā)酵生長的影響Fig. 2 Effect of the different pH on the growth of flora combination

2.3.2 接種量優(yōu)化

接種量對菌體的影響如圖3所示，對于固氮菌來說，當(dāng)接種量在50 uL～100 uL時，菌體的生長量逐漸上升，當(dāng)接種量在300 uL～400 uL，菌體生長量呈緩慢下降的趨勢，說明高接種量并不利于菌株的生長，當(dāng)接種量為100 uL時，菌體的生長達(dá)到最大，此時為最佳的接種量，即100 mL發(fā)酵液中加入100 uL菌液時，最有利于固氮菌的生長。

對于解磷菌來說，當(dāng)接種量在50 uL～300 uL時，菌體的生長量逐漸上升，當(dāng)接種量在300 uL～400 uL，菌體生長量呈緩慢下降的趨勢，因此解磷菌最佳的接種量為300 uL。

對于解鉀菌來說，接種量對解鉀菌的生長的影響總體趨勢變化不明顯，當(dāng)接種量在50 uL～100 uL時，菌體的生長量逐漸上升，當(dāng)接種量在300 uL～400 uL，菌體生長量呈緩慢下降的趨勢，當(dāng)接種量為100 uL時，發(fā)酵液中菌體的生長量最佳。

圖3 不同接種量對菌株發(fā)酵生長的影響Fig. 3 Effect of the different inoculum quantity on the growth of flora combination

2.3.3 轉(zhuǎn)速優(yōu)化

由圖4可知，轉(zhuǎn)速對固氮菌、溶磷菌、解鉀菌生長的影響趨勢一致，當(dāng)轉(zhuǎn)速在90 r·min-1～180 r·min-1時，隨著轉(zhuǎn)速的增加，菌株的生長量逐漸增加，當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到180 r·min-1時，發(fā)酵液的OD值達(dá)到最大，當(dāng)轉(zhuǎn)速繼續(xù)升高時，菌體的OD值有所下降。因此當(dāng)轉(zhuǎn)速為180 r·min-1時為固氮菌、溶磷菌、解鉀菌生長的最佳轉(zhuǎn)速。

圖4 不同轉(zhuǎn)速對菌株發(fā)酵生長的影響Fig. 4 Effect of the different revolution on the growth of flora combination

2.3.4 培養(yǎng)溫度的優(yōu)化

從圖5可以看出，溫度過高過低都不利于菌株的生長。溫度對固氮菌、溶磷菌生長的影響趨勢一致，當(dāng)溫度在22℃～30℃范圍內(nèi)，菌體的生長量呈逐漸上升的趨勢，當(dāng)溫度在30℃～38℃范圍內(nèi) ，菌體的生長量呈緩慢下降的趨勢，當(dāng)溫度為30℃時，菌體的生長量達(dá)到最大，因此固氮菌、溶磷菌最佳的發(fā)酵溫度為30℃。

對于解鉀菌來說，當(dāng)溫度22℃～34℃范圍內(nèi)，菌株的生長量呈上升的趨勢，當(dāng)溫度在34℃～38℃范圍內(nèi)，菌株的生長量略微有所下降，當(dāng)溫度為34℃時菌體的生長量達(dá)到最大，此時為解鉀菌最佳的發(fā)酵溫度。

圖5 不同溫度對菌株發(fā)酵生長的影響Fig. 5 Effect of the different temperature on the growth of flora combination

3 總結(jié)

綜合先前的研究經(jīng)驗，本研究主要選擇了培養(yǎng)基、初始pH、接種量、轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)溫度等5個因素進(jìn)行實驗。通過采用單因素實驗結(jié)合正交法實驗對上述各因素進(jìn)行優(yōu)化可知，固氮菌培養(yǎng)基的最優(yōu)組合為麥芽糖7.5 g、蛋白胨15 g、NaH2PO4·H2O 0.3 g、K2HPO40.5 g、FeCl30.2 g、MgSO4·7H20.5g，最佳pH6.8，最佳接種量為100 mL，最佳轉(zhuǎn)速為180 r·min-1最佳發(fā)酵溫度為30℃，此時菌體的生長量最大，OD600為1.085。利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵時固氮菌的OD600 0.832，因此優(yōu)化后的培養(yǎng)基的發(fā)酵效率比基礎(chǔ)培養(yǎng)基的發(fā)酵效率提高了30.4%。溶磷菌培養(yǎng)基的最優(yōu)組合為麥芽糖7.5 g、蛋白胨15 g、NaH2PO4·H2O 0.3 g、 K2HPO40.5 g、 FeCl30.5 g、

MgSO4·7H20.5 g，最佳pH值6.4，最佳接種量為300 mL，最佳轉(zhuǎn)速為180 r·min-1最佳發(fā)酵溫度為30℃，此時菌體的生長量最大，OD600為1.032。利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵時固氮菌的OD6000.753，因此優(yōu)化后的培養(yǎng)基的發(fā)酵效率比基礎(chǔ)培養(yǎng)基的發(fā)酵效率提高了37.1%。解鉀菌培養(yǎng)基的最優(yōu)組合為甘露醇7.5 g、牛肉膏15 g、NaH2PO4·H2O 0.3 g、K2HPO40.5 g、FeCl30.5 g、MgSO4·7H20.5 g，最佳pH值7.6，最佳接種量為100 mL，最佳轉(zhuǎn)速為180 r·min-1最佳發(fā)酵溫度為34℃，此時菌體的生長量最大，OD600為0.542。利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵時固氮菌的OD6000.268，因此優(yōu)化后的培養(yǎng)基的發(fā)酵效率比基礎(chǔ)培養(yǎng)基的發(fā)酵效率提高了1.02%。