高卓林，王瑩，白麗婷，李萍，汪平，董藝霖，金向群

（吉林大學藥學院，長春 130021）

復方阿膠泡騰片是由阿膠、人參、當歸等中藥材經提取后與檸檬酸、碳酸氫鈉等輔料混合后制得的用于治療貧血癥的中成藥。阿膠作為該方中的主藥，具有很強的補血滋陰功效，由驢皮經煎煮、濃縮而成固體膠[1]。以此來與不同的中藥材（當歸、黃芪等補氣血的中藥材）配制成各種中成藥發(fā)揮治療作用，在臨床上多用于治療因貧血而引起的肌痿無力、血虛萎黃等癥，尤其能夠較好治療嚴重貧血[2]。阿膠中含量最高的是氨基酸，其種類眾多，能夠減少凝血酶原時間，從而顯著提高紅細胞的增長速度，以此達到補血養(yǎng)血的功效，氨基酸是阿膠發(fā)揮療效的主要成分[3]。產品中氨基酸含量對治療作用影響很大。本試驗采用高效液相色譜法對復方阿膠泡騰片中的4 種氨基酸含量進行測定，以期為該產品后續(xù)質量控制提供依據。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

華譜S3000 高效液相色譜儀（長春寶泰科華科技有限公司）；AB204-L 電子分析天平（上海志榮電子科技有限公司）；華譜Unitary-C1（84.6mm×250mm×5um，天津奧特文科技有限公司）；US-10D 數(shù)控超聲波清洗器（中國科技儀器設備廠）；酒精噴燈（杭州萊伯斯實驗設備有限公司）；油浴鍋（上海越眾儀器設備有限公司）。

1.2 材料與試劑

甘氨酸、L-羥脯氨酸、丙氨酸和L-脯氨酸標準品（北京世紀奧科生物技術有限公司，批號分別是180910、181217、180619、190129）；色譜純乙腈（美國費世爾公司）；化學純異硫氰酸苯酯（上海麥克林生化科技有限公司）；分析純結晶乙酸鈉、醋酸、鹽酸、醋酸鈉、三乙胺、環(huán)己烷（北京化工廠）；純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Unitary C1（8250 mm×4.6 mm，5um）；流動相：A 相為乙腈∶0.1 mol/L 醋酸鈉溶液（醋酸調節(jié)pH為6.5）（7∶93），B相為乙腈∶水（4∶1），將兩相按照表1中規(guī)定進行梯度洗脫；流速：1 mL/min；波長：254 nm；柱溫：43 ℃；進樣量：5uL/min。

表1 流動相梯度洗脫表Table 1 Mobile phase gradient elution table

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 精密稱定L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸對照品適量，置于50 mL 容量瓶中，用配制好的0.1 mol/L鹽酸溶液溶解并定容至刻度線，制成各氨基酸濃度分別為76.8、159.8、71.2、121.2ug/mL 的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取復方阿膠泡騰片粉末，精密稱定1.8 g，加入20 mL 的0.1 mol/L 鹽酸溶液，超聲（250 W，40 kHz）處理30 min，取出冷卻至室溫后，用上述的0.1 mol/L 鹽酸溶液進行定容。用移液管精密量取2mL，加入等體積的鹽酸溶液于安瓿瓶中，150 ℃水解1 h，使蛋白質在酸性條件下充分水解為氨基酸，冷至室溫，用10 mL 水分次洗滌安瓿瓶，將內容物與洗液合并，水浴蒸干。殘渣用0.1 mol/L 的鹽酸溶液定容至25 mL。

2.2.3 衍生化 精密量取混合對照品溶液5 mL，置于25 mL容量瓶中，加入2.5 mL異硫氰酸苯酯（PITC）乙腈溶液（取PITC 0.6 mL，用乙腈定容至50 mL），再加入2.5 mL 三乙胺乙腈溶液（取7.1 mL 三乙胺，用乙腈定容至50 mL），搖勻后靜置1 h 進行衍生化，最終用乙腈∶水（1∶1）溶液定容至刻度線。

取10 mL 于分液漏斗中，加入等體積正己烷靜置5 min，以除去衍生過程中產生的雜質，取下層溶液過濾即得。

將供試品溶液和陰性樣品溶液按照相同處理方法進行衍生化[4-6]，以備進樣。

2.2.4 測定 將衍生化處理后的對照品溶液、供試品溶液分別注入色譜儀，進樣量均為5uL，記錄色譜圖（見圖1）。

2.3 標準曲線

用0.1 mol/L 的鹽酸溶液對混合對照品溶液進行稀釋，稀釋后L-羥脯氨酸的濃度分別為11.52、23.04、34.56、46.08、57.60、69.12ug/mL；甘氨酸的濃度分別為 23.97、47.94、71.91、95.88、119.85、143.82ug/mL；丙氨酸的濃度分別為 10.68、21.36、32.04、42.72、53.40、64.08ug/mL；L-脯氨酸的濃度分別為18.18、26.26、54.54、72.72、90.90、109.08ug/mL。將各對照品溶液進行衍生化后，進樣體積為5uL，注入色譜儀進行線性分析。得到4 種氨基酸的回歸方程（表2）。

圖1 混合對照品（A）與樣品（B）HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC of mixture of reference material（A）and sample（B）

表2 線性方程及相關系數(shù)Table 2 Linear equation and correlation coefficient

結果表明，L-羥脯氨酸在11.52～69.12ug/mL、甘氨酸在 23.97～143.82ug/mL、丙氨酸在 10.68～64.08ug/mL、L-脯氨酸在18.18～109.08ug/mL 濃度內線性關系較好。

2.4 精密度試驗

衍生化后的混合對照品溶液重復6 次進樣，每次進樣5uL，記錄6 次的峰面積，并計算RSD 值。測得4 種氨基酸峰面積的RSD（n=6）分別為0.37%、0.52%、0.46%、0.69%，均小于2%，結果表明，精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗

將同批次復方阿膠泡騰片的供試品溶液放置在室溫條件下，于 0、2、8、12、16、24 h 進行液相分析，記下各時間點的峰面積，計算得到4 種氨基酸峰面積的RSD 分別為0.93%、1.08%、0.72%、0.36%，結果表明，該產品在24 h 內具有良好的穩(wěn)定性。

2.6 重復性試驗

取同一批次樣品粉末6 份，按照上述方法進行樣品處理，經PITC 衍生化后每份精密吸取5uL 注入高效液相色譜儀進行定量分析，結果測得L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸的含量均值分別為9.345 9、20.520 0、10.580 0、14.736 0 mg/g，RSD 分別為 0.87%、1.27%、0.90%、1.12%，表明該方法重復性良好。

2.7 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的復方阿膠泡騰片粉末6 份，每份加入同量的4 種氨基酸對照品，進行樣品處理和衍生化處理后，進樣體積為5uL 進行定量分析，并分別計算回收率，結果顯示，L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸平均回收率（n=6）分別為98.65%、100.24%、101.94%、100.33%，RSD分別為0.95%、0.87%、0.90%、0.53%（表3）。4 種氨基酸的平均加樣回收率和RSD均在合格范圍內，表明該方法的回收率較好。

表3 回收率測定結果Table 3 Recovery results

2.8 樣品含量測定

分別取批號 20181022、20181024、20181026 這3批樣品，每批樣品取3 份，進行樣品溶液制備和衍生化處理后，精密量取5uL 進樣，記錄4 種氨基酸的峰面積，并計算各個成分的含量均值（表4）。

表4 樣品含量測定Table 4 Assaying of sample （mg/g）

3 討論

3.1 流動相的選擇

本試驗在試驗初期曾選用乙腈∶0.1 mol/L 醋酸鈉溶液（3∶97）作為流動相A，但色譜圖結果顯示，丙氨酸和L-脯氨酸不能夠完全分離，因此最后根據《中華人民共和國藥典》（2015年版）將流動相A的比例調整改善為乙腈∶0.1 mol/L 醋酸鈉溶液（7∶93），在該條件下，4 種氨基酸均達到了較好的分離。

3.2 供試品的制備

氨基酸自身的紫外吸收較弱，因此需要進行衍生化，本試驗選用異硫氰酸苯酯進行柱前衍生化，將氨基酸衍生成伯氨基或仲氨基，從而產生較強的紫外吸收，且通過正己烷萃取后除去干擾因素，經過濾后直接進行高效液相色譜分析。

4 小結

本試驗建立了測定復方阿膠泡騰片中4 種氨基酸含量的高效液相色譜法，其結果顯示，本方法的專屬性及樣品精密度、穩(wěn)定性均較好，為該產品的質量控制提供了依據，也為其他含有阿膠的復方產品質量控制提供了參考。