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        HPLC法測(cè)定人參花茶和人參花紅茶中13種人參皂苷含量

        2019-09-21 08:35:24董慶海王涵曹瑩楊錄軍崔寶仁王清劉金平李平亞王松
        特產(chǎn)研究 2019年3期

        董慶海,王涵,曹瑩,楊錄軍,崔寶仁,王清,劉金平,李平亞,王松※

        (1.吉林大學(xué)藥學(xué)院,長(zhǎng)春 130021;2.吉林紫鑫藥業(yè)股份有限公司,長(zhǎng)春 130022;3.撫松縣晟宏生態(tài)人參有限公司,吉林 白山 134500)

        人參(Panax ginseng C.A.Mey)為五加科人參屬多年生草本植物,被《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品,有“百草之王”的美譽(yù)[1],主要生長(zhǎng)在我國(guó)東北地區(qū)[2]。人參花系人參未開(kāi)放的花蕾,又名“神草花”,呈暗綠色,質(zhì)脆,易碎,氣香,性溫和,味甘微苦,有清熱消炎、平肝清火、解毒利咽、降血壓等功效,是天然的補(bǔ)品,素有“綠色黃金”之稱(chēng)[3-4]。每株人參僅開(kāi)1 朵花,每年6月中旬左右人參花蕾才能孕育成熟,此時(shí)方可采摘[5]。近年來(lái),隨著對(duì)人參花研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)人參花中人參皂苷的含量是根的5 倍[6],參與調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫網(wǎng)絡(luò),增強(qiáng)免疫力[7],但不含Ro皂苷,服用不會(huì)使人上火[8],揮發(fā)油含量也高于根、莖[9],人參總多糖含量是根的2~5倍[5],此外,人參花有其特有成分,人參花蕾9 肽和人參花蕾11 肽屬于小分子,極易吸收,可快速準(zhǔn)確地識(shí)別機(jī)體內(nèi)的cAMP-cGMP平衡,使人體維持健康狀態(tài)[10]。

        通過(guò)人工采集人參花,經(jīng)日曬、烘干、發(fā)酵等工藝,可制成人參花茶和人參花紅茶,風(fēng)味獨(dú)特,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高,充分發(fā)揮了人參花的保健作用。人參花茶和人參花紅茶作為一種新興保健飲品,市場(chǎng)前景巨大,然而,在《中國(guó)藥典》中只記載了人參根和人參葉的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn),并未見(jiàn)關(guān)于人參花及人參花茶的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。因此,本研究應(yīng)用HPLC 法建立了人參花茶和人參花紅茶中13 種人參皂苷的定性、定量分析方法,旨在為其質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供參考。

        1 儀器與試藥

        1.1 儀器

        98-1-B 型電子調(diào)溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司);FA1104N 型電子分析天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司);ACchrom S6000 型高效液相色譜儀(華譜新創(chuàng)科技有限公司)。

        1.2 試藥

        乙腈(色譜純,美國(guó)Fisher 試劑公司);甲醇(分析純,天津新通精細(xì)化工有限公司);磷酸(分析純,北京化工廠);純凈水(白山娃哈哈飲料有限公司);人參皂苷Rg1、Rc、Rb2、Rb3、F1、F2、Rb1、Rh1對(duì)照品(吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院自制);人參皂苷CK 對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所);人參皂苷Re、Rg2、Rd、Rg3對(duì)照品(吉林大學(xué)天然藥物研究中心自制)。

        人參花茶1 號(hào)、2 號(hào)、3號(hào)(生產(chǎn)日期為2018.12.10)和人參花紅茶 4 號(hào)、5 號(hào)、6 號(hào)(生產(chǎn)日期 2019.01.10),均由吉林紫鑫藥業(yè)提供。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 對(duì)照品溶液的制備

        稱(chēng)取人參皂苷對(duì)照品適量,置于容量瓶中,加入甲醇溶解并定容,配制成Rg1(0.68mg/mL)、Re(0.74mg/mL)、Rh1(0.36 mg/mL)、Rg2(0.42 mg/mL)、Rb1(0.16 mg/mL)、Rc(0.3 mg/mL)、F1(0.1 mg/mL)、Rb2(0.44 mg/mL)、Rb3(0.36 mg/mL)、Rd(0.38 mg/mL)、Rg3(0.24 mg/mL)、F2(0.22 mg/mL)、CK(0.26mg/mL)的混合對(duì)照品溶液。

        2.2 供試品溶液的制備

        平行稱(chēng)取人參花茶、人參花紅茶4 g 2 份,加水煎煮2 次,每次100 mL,每次2 h,煎液濾過(guò)合并,通過(guò)D101 型大孔樹(shù)脂柱,上樣吸附4 h。用水洗脫至無(wú)色,再用60%乙醇洗脫至無(wú)皂苷反應(yīng),收集60%乙醇洗脫液[11],濃縮,85℃蒸干,在250 mL容量瓶中甲醇定容,0.45um針式過(guò)濾器濾過(guò),取續(xù)濾液,即得供試品、平行供試品。

        2.3 色譜條件

        色譜柱:Unitary C1(8250 mm×4.6 mm,5um);柱溫:30℃;檢測(cè)波長(zhǎng):203nm;流速:1.3mL/min;進(jìn)樣量:10uL;流動(dòng)相:乙腈 0.05%磷酸水溶液;梯度洗脫[12](表1)。

        表1 流動(dòng)相洗脫梯度程序Table 1 Mobile phase elution gradient program

        2.4 方法學(xué)考察

        2.4.1 精密度 取同一批人參花茶供試品溶液,在“2.3”項(xiàng)下測(cè)定,連續(xù)進(jìn)樣5 次。計(jì)算13 種人參皂苷峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),RSD 為0.86%~2.87%,表明儀器的精密度良好。

        2.4.2 重現(xiàn)性 取同一批次人參花茶樣品,按“2.2”項(xiàng)方法制備5 批供試品溶液,在“2.3”項(xiàng)下測(cè)定,連續(xù)進(jìn)樣5次。計(jì)算13 種人參皂苷峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),RSD 為0.76%~2.94%,表明本方法重復(fù)性良好。

        2.4.3 穩(wěn)定性 取同一人參花茶供試品溶液,在“2.3”項(xiàng)下測(cè)定,分別在 2、4、6、12、24h 進(jìn)樣。計(jì)算 13 種人參皂苷峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),RSD為0.89%~2.93%,表明供試品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

        2.4.4 加樣回收率 稱(chēng)取同一人參花茶樣品1 g 3 份,分別置于具塞錐形瓶中,分別加入一定量人參皂苷混合對(duì)照品溶液,按照供試品制備方法制備后測(cè)定。樣品加樣回收率在94.1%~103.4%,RSD 為0.97%~5.32%。

        2.4.5 線(xiàn)性關(guān)系 吸取混合對(duì)照品溶液4、6、10、15、20uL 分別進(jìn)樣,記錄HPLC 譜圖。以對(duì)照品的量(ug)為橫坐標(biāo)、對(duì)照品的峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析,結(jié)果見(jiàn)表2。

        表2 單體人參皂苷峰面積-含量線(xiàn)性回歸方程和相關(guān)系數(shù)Table 2 Linear regression equation and correlation coefficient of monomer ginsenoside peak area-content

        2.5 樣品含量測(cè)定

        取不同批次的人參花茶、人參花紅茶,按“2.2”項(xiàng)下方法制備,在“2.3”項(xiàng)下測(cè)定,混合標(biāo)準(zhǔn)品及人參花茶、人參花紅茶的HPLC 色譜圖見(jiàn)圖1,測(cè)定13 種人參皂苷含量的結(jié)果見(jiàn)表3。

        圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品及人參花茶、人參花紅茶樣品的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of mixed standard,ginseng flower tea and ginseng flower black tea samples

        表3 人參花茶和人參花紅茶樣品的人參皂苷含量Table 3 Ginseng saponin content of ginseng flower tea and ginseng flower black tea samples (mg/g)

        3 結(jié)論與討論

        本研究依據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版(一部)人參莖、葉總皂苷的制法,制備人參花茶和人參花紅茶的供試品溶液,在最大程度保留人參皂苷的同時(shí),去除其他雜質(zhì)。本試驗(yàn)采用HPLC 法,建立了2 種人參花茶6 組樣品中13 種人參皂苷類(lèi)成分的定性、定量分析方法,涵蓋了絕大多數(shù)人參皂苷成分,能夠系統(tǒng)全面地鑒定人參花茶中人參皂苷的種類(lèi)及含量。結(jié)果表明,2 種人參花茶均含有13 種人參皂苷。人參花茶和人參花紅茶中人參皂苷Rd、Re、Rc、Rg2的含量存在差異,人參花茶中人參皂苷Rd、Re、Rc 的含量高,人參花紅茶中人參皂苷Rg2的含量高,是區(qū)分2 種花茶的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。人參花茶和人參花紅茶樣品均含有豐富的人參皂苷營(yíng)養(yǎng)成分及功能因子,但二者之間也存在一定的差異,與這2 種花茶的制作工藝有關(guān)。

        本試驗(yàn)建立的HPLC 檢測(cè)方法,能在同一色譜條件下同時(shí)對(duì)人參花茶和人參花紅茶中13 種主要人參皂苷的含量進(jìn)行測(cè)定,建立了同一色譜條件測(cè)定多種人參皂苷類(lèi)成分含量的測(cè)定方法。本方法簡(jiǎn)便、快捷,且分析結(jié)果全面可靠,為人參花茶和人參花紅茶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了科學(xué)依據(jù)。

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