張志 呂建偉 覃開羽 吳敏 張蓓 李俊偉 王瑩 馮秀芳 盧森華

摘要：采用HLPC法，色譜柱為Agilent Eclipse-C18柱，檢測波長為330 nm，流動相為甲醇-0.2%磷酸水溶液梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，通過中藥色譜指紋圖譜相似度評價結(jié)合主成分分析對10批次銀菊合劑樣品進(jìn)行研究。結(jié)果表明，標(biāo)定出11個共有峰，定性了3個共有峰，指紋圖譜相似度均在0.9以上，符合指紋圖譜研究技術(shù)要求，影響制劑質(zhì)量差異是多成分協(xié)同作用的結(jié)果。

關(guān)鍵詞：銀菊合劑;HPLC;化學(xué)計量學(xué);指紋圖譜

中圖分類號：O69? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）16-0110-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.16.025? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract： Using HLPC， Agilent Eclipse-C18 column， detection wavelength 330 nm， mobile phase was methanol-0.2% phosphoric acid gradient elution， flow rate was 1.0 mL/min. 10 batches of Yinju mixture samples were studied by similarity evaluation of chromatographic fingerprints of traditional Chinese medicine. Results showed that thirteen common peaks were calibrated and three common peaks were qualitatively identified. The similarity of fingerprints was above 0.9， which met the requirements of fingerprint technology. The synergistic effect of multi-components affected the quality of preparations.

Key words： Yinju mixture; HPLC; chemometrics; fingerprint

銀菊合劑是柳州市中醫(yī)醫(yī)院經(jīng)驗方，通過多年臨床觀察證明其具良好的清熱解毒、疏散風(fēng)熱作用，常用于風(fēng)熱感冒、頭痛眩暈、目赤腫痛、瘡毒或壯熱口渴、小兒胎毒等病癥的治療，且療效顯著。銀菊合劑組方含山銀花和菊花二味中藥，山銀花（Lonicera hypoglauca）性甘寒，歸肺、心、胃經(jīng)，具有清熱解毒，涼散風(fēng)熱的功效[1]，為君藥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，山銀花中具有抗菌、抗病毒、解熱、抗氧化及保護(hù)肝臟的作用[2，3]。山銀花的質(zhì)量控制除了法定標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的外觀、性狀、鑒別及以綠原酸含量為指標(biāo)進(jìn)行質(zhì)量控制外，多集中于不同產(chǎn)地、不同加工方法山銀花有效成分的含量測定，并越來越傾向于多種成分的同時測定[4，5];HPLC指紋圖譜可用于山銀花藥材、提取物品質(zhì)的鑒定[6]。菊花[Dendranthema morifolium（Ramat. ）Tzvel.]性苦、辛、微寒，歸肝、心經(jīng)，散風(fēng)清熱，平肝明目，清熱解毒，以增強(qiáng)主藥之功效[1]，為臣藥。菊花具有抗菌、抗炎、舒血管、抗氧化、抗腫瘤等藥理活性[7，8]。二藥配伍，苦寒瀉火以解毒，甘寒化陰以補(bǔ)虛，標(biāo)本兼顧，共奏清熱解毒、疏散風(fēng)熱之效。中藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜，目前采用定量部分指標(biāo)性成分的方法難以全面控制其質(zhì)量，中藥指紋圖譜技術(shù)有利于整體獲取中藥活性組分群，已成為中藥真?zhèn)蝺?yōu)劣鑒別、質(zhì)量一致性評價和產(chǎn)品穩(wěn)定性考察的可行模式[9，10]。

目前，指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計量學(xué)已被廣泛地應(yīng)用于中成藥的質(zhì)量控制[11]，但有關(guān)銀菊合劑指紋圖譜的研究甚少。本研究采用HPLC結(jié)合化學(xué)計量學(xué)對銀菊合劑進(jìn)行指紋圖譜研究，為科學(xué)評價和有效控制銀菊合劑的質(zhì)量提供參考依據(jù)，為下一步形成具有自主知識產(chǎn)權(quán)的成果和產(chǎn)業(yè)化奠定基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料

1.1.1? 試劑? 銀菊合劑樣品來源于柳州市中醫(yī)醫(yī)院，制備銀菊合劑所用飲片購于廣西柳州醫(yī)藥股份有限公司、國藥控股柳州有限公司和廣西柳州百草堂中藥飲片廠責(zé)任有限公司，經(jīng)柳州市中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部中藥庫唐鳳嵐副主任中藥師鑒定：山銀花為忍冬科植物灰氈毛忍冬（Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.）、紅腺忍冬（Lonicera hypoglauca Miq.）、華南忍冬（Lonicera Confusa DC.）或黃褐毛忍冬（Lonicera fulvotomentosa Hsu et S.C.Cheng）的干燥花蕾或帶初開的花;菊花為菊科植物菊（Chrysanthemum morifolium Ramat.）的干燥頭狀花序，藥材形狀特征與《中國藥典》2015年版描述一致，各飲片產(chǎn)地來源、批號信息見表1。綠原酸（批號110753-201415）、咖啡酸（批號110885-200102）、木犀草苷（批號111720-2013）均由中國食品藥品檢定研究院提供。乙腈、甲醇（美國Fisher公司，色譜純），磷酸（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，優(yōu)級純），高效液相色譜儀用水為超純水，其他所用試劑均為分析純。

1.1.2? 儀器? 1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）;XS-205Du型電子分析天平（瑞士梅特勒公司）;HH-S6型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠）;Synergy型超純水機(jī)（美國密里博公司）。

1.2? 方法

1.2.1? 混合對照品溶液的配制? 分別精密稱定綠原酸、咖啡酸、木犀草苷對照品10 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再分別精密量取上述3種對照品準(zhǔn)備液1.0 mL，置于同一10 mL量瓶中，用甲醇定容，即得。

1.2.2? 供試品溶液的制備? 精密量取銀菊合劑2.0 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

1.2.3? 色譜條件? 色譜柱為Agilent Eclipse-XDB C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流速為1.0 mL/min;檢測波長為330 nm;柱溫為30 ℃;進(jìn)樣量為5 μL;流動相為甲醇-0.2%磷酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫（乙腈體積分?jǐn)?shù)在0→5 min為10%，5→50 min為10%→90%）。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 精密度試驗

取S1號銀菊合劑2.0 mL制備供試品溶液，按“1.2.3”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果表明，各色譜峰相對保留時間的RSD為0.01%～0.03%，各色譜峰相對峰面積的RSD為0.02%～0.30%，該試驗精密度良好。

2.2? 重復(fù)性試驗

取6份S1號銀菊合劑供試品溶液，按“1.2.3”色譜條件進(jìn)行測定，考察樣品的重復(fù)性。結(jié)果表明，6份樣品的各色譜峰相對保留時間的RSD為0.04%～0.10%;各色譜峰相對峰面積的RSD為0.4%～3.7%，該方法的重復(fù)性良好。

2.3? 穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液，按“1.2.3”色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，考察供試品溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，各色譜峰相對保留時間的RSD為0.01%～0.08%;各色譜峰相對峰面積的RSD為0.08%～3.60%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.4? 指紋圖譜的建立及相似度分析

2.4.1? 參照色譜峰的建立? 綠原酸為銀菊合劑中已知主要成分，而且綠原酸所在指紋圖譜中的2號峰保留時間適中，分離度良好，峰面積較大且為共有峰，故選用綠原酸（2號峰）作為參照峰，見圖1。

2.4.2? 指紋圖譜的采集[12]? 精密量取10批次的銀菊合劑2.0 mL，按“1.2.2”方法制備供試品溶液，并按“1.2.3”色譜條件進(jìn)行測定，記錄10批次銀菊合劑的色譜圖及數(shù)據(jù)，建立銀菊合劑HPLC指紋圖譜（圖2），10批銀菊合劑HPLC疊加色譜圖如圖3所示。

2.4.3? 共有峰的確定? 運(yùn)用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版》計算機(jī)軟件對指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析評價，10批次圖譜都具有的色譜峰標(biāo)定為共有指紋圖譜峰。選擇1號銀菊合劑的圖譜為參照圖譜，以平均數(shù)法作為生成對照指紋圖譜的方法，設(shè)定時間窗寬度為0.1 min，軟件自動匹配圖譜，系統(tǒng)根據(jù)銀菊合劑的共有模式，生成對照指紋圖譜為銀菊合劑指紋圖譜。以參照峰的保留時間和峰面積作為1，分別計算10批銀菊合劑共有指紋峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果見表2、表3。結(jié)果表明，不同批次的銀菊合劑共有峰相對保留時間RSD為0.1%～1.0%，相差較小;而相對峰面積RSD相差較大。本試驗建立的色譜方法可以使不同批次的銀菊合劑具有基本一致的色譜行為，即各批次銀菊合劑樣品在化學(xué)成分種類上基本一致，但不同批次之間各種化學(xué)成分的含量受多種因素的影響，因此各峰的峰面積有所差異，各成分的含量有差異。

2.4.4? 共有峰的指認(rèn)? 利用對照品對照法對共有峰進(jìn)行指認(rèn)，取綠原酸、咖啡酸、木犀草苷對照品，配制成適量濃度，按照“1.2.3”色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果顯示3種對照品的保留時間分別與特征色譜圖中的2、3、7號峰保留時間一致，并通過在線紫外吸收光譜對照，2、3、7號峰分別與綠原酸、咖啡酸、木犀草苷對照品峰一致，因此可以確定2號峰為綠原酸、3號峰為咖啡酸、7號峰為木犀草苷，這些特征峰可作為控制銀菊合劑質(zhì)量的指標(biāo)之一。

2.4.5? 相似度評價? 選擇S1號銀菊合劑樣品的圖譜為參照圖譜，以平均數(shù)法作為生成對照指紋圖譜（SR）的方法，時間窗寬度設(shè)定為0.1 min，然后進(jìn)行譜峰識別和譜峰匹配，結(jié)果見圖3。系統(tǒng)根據(jù)銀菊合劑樣品的共有模式，生成銀菊合劑對照指紋圖譜并計算相識度，結(jié)果見圖4和表4。結(jié)果表明，10批次銀菊合劑樣品與對照指紋圖譜（SR）的相似度均大于0.9，說明各批次銀菊合劑樣品圖譜與對照指紋圖譜有較好的一致性，完全符合HPLC指紋圖譜技術(shù)要求。

2.4.6? 主成分分析? 以10批次銀菊合劑樣品色譜數(shù)據(jù)的11個共有峰的峰面積為變量，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行主成分分析[13]，以主成分的特征根和貢獻(xiàn)率作為選擇主成分的依據(jù)，提取到2個主成分的特征根大于1的主成分，2個主成分特征值分別為6.690%、2.664%，方差貢獻(xiàn)率分別為60.814%、24.220%，且它們的累積方差貢獻(xiàn)率大于85.034%，結(jié)果見表5。從PCA碎石圖（圖5）可以看出，先提取出來的2個主成分的坡度較為陡峭，說明所提取的 2個主成分可以代表銀菊合劑樣品的質(zhì)量。根據(jù)因子荷載矩陣，推測影響銀菊合劑樣品質(zhì)量差異的并不是單一成分，而是多成分協(xié)同作用的結(jié)果。從表6和圖6中可以看出，第1主成分的信息主要來自于色譜峰 2、3、5、7、10、11的信息;第2主成分主要來自色譜峰1、4、6、8、9的信息。

3? 討論

中藥制劑的生產(chǎn)是一個復(fù)雜的過程，生產(chǎn)環(huán)節(jié)、影響因素多，生產(chǎn)中任何環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，均對制劑產(chǎn)品的安全有效造成影響。中藥自身毒性或潛在毒性、中藥之間相互作用、配伍禁忌或者臨床用藥不合理等因素會引發(fā)中藥制劑的安全問題。中藥制劑的藥材來源、處方、制備成型工藝、輔料、儲存、運(yùn)輸?shù)壬婕爸兴幹苿┑馁|(zhì)量問題[14]。中藥制劑指紋圖譜則通過各色譜峰的峰面積或峰高比值來確定樣品中化學(xué)成分的相對量，并結(jié)合數(shù)理統(tǒng)計方法通過相似度的比較來評價該制劑質(zhì)量的優(yōu)劣，能較為全面地反映中藥制劑中所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量，尤其是在現(xiàn)階段有效成分大部分未明確的情況下，能較全面地反映中藥制劑的內(nèi)在質(zhì)量[15]。

從10批樣品的高效液相色譜指紋圖譜中可以看出，不同批次銀菊合劑各色譜峰的相對保留時間基本一致，所含成分基本相同，符合指紋圖譜的要求。本研究建立銀菊合劑指紋圖譜，為銀菊合劑的質(zhì)量控制提參考，進(jìn)而對于其相應(yīng)制劑的質(zhì)量控制也會起積極的作用。

參考文獻(xiàn)：

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

[2] 李錦桑，吳洪文.山銀花化學(xué)成分與藥理活性研究進(jìn)展[J].北方藥學(xué)，2014，11（2）：71-73.

[3] 王? 芳，高? 松.金銀花、山銀花藥理學(xué)研究現(xiàn)狀[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2013，15（4）：237-239.

[4] 舒勝輝.不同產(chǎn)地山銀花有效成分綠原酸含量的比較研究[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報，2006，12（5）：74-75.

[5] 王天志，李永梅，王志宵.金銀花中3種有機(jī)酸的反相高效液相色譜法定量分析[J].藥物分析雜志，2000，20（5）：293-296.

[6] 晏永新，鐘? 鐵，張小娟，等.山銀花不同產(chǎn)地加工品的HPLC指紋圖譜研究[J].中草藥，2007，38（11）：1643-1645.

[7] 謝占芳，張倩倩，朱凌佳，等.菊花化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展[J].河南大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2015，34（4）：290-300.

[8] 張曉媛，段立華，趙? 丁.菊花化學(xué)成分及藥理作用的研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2008，19（7）：1702-1704.

[9] 李? 強(qiáng)，杜思邈，張忠亮，等.中藥指紋圖譜技術(shù)進(jìn)展及未來發(fā)展方向展望[J].中草藥，2013，44（22）：3095-3104.

[10] 侯湘梅，岳洪水，張? 磊，等.中藥質(zhì)量一致性評價探討[J].藥物評價研究，2016，39（1）：38-45.

[11] 嚴(yán)寶飛，朱邵晴，宿樹蘭，等.不同產(chǎn)地黃芩莖葉UPLC指紋圖譜與化學(xué)模式識別研究[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2017，11（33）：633-638.

[12] 劉吉成，盧森華，謝? 巍，等.廣西多葉越南槐HPLC指紋圖譜的建立及與山豆根HPLC指紋圖譜一致性比較研究[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2014，4（1）：117-119.

[13] 聶? 韡，朱培林，房海靈，等.HPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計量學(xué)評價不同產(chǎn)地廣東紫珠藥材的質(zhì)量[J].中草藥，2017，48（1）：185-191.

[14] 顧俊菲，封? 亮，張明華，等.中藥產(chǎn)品“多維結(jié)構(gòu)過程動態(tài)質(zhì)量控制技術(shù)體系”構(gòu)建與應(yīng)用（I）[J].中國中藥雜志，2013，38（21）：3613-3617.

[15] 梁小銀，陳少旭，吳? 垠.中藥制劑質(zhì)量控制研究的發(fā)展趨勢[J].中國藥房，2014，25（3）：280-283.