孫敏秀 王麗麗 楊 銳 陳海敏,*

(1 寧波大學(xué)浙江省海洋生物工程重點實驗室，浙江 寧波 315211；2 寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 寧波 315040)

施用農(nóng)藥已成為防治植物病蟲害、去除雜草、調(diào)節(jié)農(nóng)作物生長和提高農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量的重要措施之一。然而，大量及不合理使用農(nóng)藥會對人類健康和環(huán)境造成嚴(yán)重危害[1]。因此，探索降低農(nóng)藥殘留的方法，是實現(xiàn)果蔬高效、安全生產(chǎn)的關(guān)鍵。

瓊膠寡糖是瓊膠進一步降解得到的一種低聚合度的寡糖分子。生物活性研究顯示，瓊膠寡糖具有抑菌、抗氧化、抗炎及抗腫瘤作用[2-4]，對植物具有激發(fā)子活性。如瓊膠寡糖可作為信號分子被壇紫菜所識別，通過調(diào)節(jié)藻體的防御反應(yīng)，誘導(dǎo)活性氧爆發(fā)，減少藻體附生細(xì)菌的數(shù)量，從而增強壇紫菜的抗?fàn)€性[5-7]。瓊膠寡糖能誘導(dǎo)真江蘺中寡糖氧化酶的表達，催化寡糖氧化脫氫生成醛類和過氧化氫(H2O2)[8]。此外，瓊膠寡糖也可作為葉面肥料，促進秋葵的生長及營養(yǎng)品質(zhì)的提高[9]。然而，有關(guān)瓊膠寡糖在促進黃瓜(CucumissativusL.)生長、提高黃瓜抗性反應(yīng)以及對黃瓜農(nóng)藥殘量影響的研究尚鮮見。本研究以瓊膠寡糖處理黃瓜，觀察其對黃瓜生長、抗性相關(guān)酶活與基因表達的影響，初步探究瓊膠寡糖作為植物激發(fā)子的作用，并通過測定黃瓜的農(nóng)藥殘留變化，探索其降低農(nóng)藥殘留的可行性，旨在為瓊膠寡糖的開發(fā)及其在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用水果黃瓜為碧翠18號，由浙江勿忘農(nóng)種業(yè)股份有限公司育成。聚合度2～10的瓊膠寡糖由浙江省海洋生物工程重點實驗室自制。挺克啶蟲脒購自寧波三江益農(nóng)化學(xué)有限公司。田間試驗于2018年3-6月在寧波橫溪鎮(zhèn)寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院基地進行。

1.2 試驗設(shè)計

待黃瓜幼苗長至二葉一心時，選取長勢一致的幼苗移栽至大棚。試驗共設(shè)置3個瓊膠寡糖處理濃度：0(CK)、100、200 μg·mL-1，均勻地噴施在葉片上，每周固定噴施1次。每處理30株，3個重復(fù)。田間管理同常規(guī)。

1.3 各項指標(biāo)的測定

植株生長指標(biāo)及產(chǎn)量測定：處理后第1～第5周，分別從各處理組中隨機挑選15株黃瓜植株測定株高，并于第5周測定黃瓜植株的莖粗、單葉葉面積[10]和葉綠素相對含量，分別用游標(biāo)卡尺、直尺和SPAD-502葉綠素儀(美能達公司，日本)測定。摘果后，記錄各處理組摘果重量，以小區(qū)面積產(chǎn)量折算每667 m2的總產(chǎn)量。

抗性相關(guān)酶活檢測：坐果后，選取同一位置、外形完好的黃瓜功能葉片進行酶活性及幾丁質(zhì)酶(chitinase)和病程相關(guān)蛋白 1(PR1-1a)基因的差異表達檢測。采用試劑盒法分別測定黃瓜葉片超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化物酶(peroxidase，POD)、多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)、過氧化氫酶(catalase，CAT)活性以及丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量(南京建成生物工程研究所，產(chǎn)品序號分別為A001、A084、A136、A007、A003)。

基因差異表達的檢測：提取葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA進行定量PCR測定。以黃瓜18S作為內(nèi)參，引物為18S-QF：5′-TGGACTCTGGTGATGGTGTTA-3′和18S-QR：5′-CAATGAGGGATGGCTGGAAAA-3′。幾丁質(zhì)酶引物為CH-QF：5′-GCCGCAGTGTCCAATACCAG-3′和CH-QR：5′-TCAGGAGATTGTCCGCGTTA-3′；PR1-1a引物為PR1-QF：5′-AACTCTGGCGGACCTTAC-3′和PR1-QR：5′-TCAATATGGCCTTTGGTATA-3′。所有基因均采用同一擴增程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性10 s、55℃退火10 s、72℃延伸40 s，共45個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法[11]計算基因相對表達量。

1.4 啶蟲脒殘留檢測

待黃瓜坐果后，選取大小約為成熟個體一半的黃瓜為試驗對象并進行標(biāo)記，考慮農(nóng)藥質(zhì)量、農(nóng)藥半衰期以及實際應(yīng)用等因素，于5月7日選取0.2 g·kg-1的啶蟲脒對試驗黃瓜進行均勻噴施。于施藥后0(4 h)、1、3、5、7 d采用多點混合采樣法采集果實。按照GB/T 20769-2008[12]中啶蟲脒殘留量測定方法進行測定。

此外，采集施藥后4 d 的0(CK)μg·mL-1處理組黃瓜進行瓊膠寡糖溶液浸泡處理。采集的黃瓜分為4個處理，空白組不作任何處理，其他三組分別放入0、100和200 μg·mL-1瓊膠寡糖溶液中浸泡30 min，取出吹干，進行啶蟲脒殘留量檢測。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 8.0和DPS 17.10高級版軟件對數(shù)據(jù)進行處理，試驗數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用Duncan’s多重極差檢驗進行顯著性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 瓊膠寡糖對黃瓜生長和產(chǎn)量的影響

由表1可知，瓊膠寡糖處理后的黃瓜植株的莖粗、葉面積、單葉葉綠素相對含量較CK都有顯著增加(P<0.05)。如200 μg·mL-1瓊膠寡糖組的葉綠素相對含量增長率達到20.26%。此外，黃瓜產(chǎn)量也受瓊膠寡糖溶液的影響顯著增加，200 μg·mL-1瓊膠寡糖處理下，其產(chǎn)量較CK增加15.38%(P<0.05)。由此可知，噴施瓊膠寡糖對黃瓜的生長及產(chǎn)量均產(chǎn)生了明顯的促進作用。

注：同列不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。
Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference among treatments at 0.05 level.

在黃瓜的整個生長期間，株高始終處于不斷變化中。由圖1可知，10、200 μg·mL-1瓊膠寡糖溶液都促進了黃瓜植株的生長，在第5周各處理組之間差異達到最大，與CK相比，100 μg·mL-1瓊膠寡糖處理組黃瓜株高顯著增加22.14%，200 μg·mL-1瓊膠寡糖處理組效果更好，其黃瓜株高顯著增加了25.82%(P<0.05)。

注：不同小寫字母表示同一時間下不同處理組間差異顯著(P<0.05)。Note: Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level between treatments at the same time. 圖1 黃瓜株高的動態(tài)變化Fig.1 Dynamic change diagram of cucumber plant heights

2.2 瓊膠寡糖對黃瓜葉片抗氧化酶活性以及MDA含量的影響

由圖2可知，不同濃度的瓊膠寡糖使葉片中的SOD、POD、CAT、PPO活性明顯升高。與CK相比，SOD活性在處理4 h時即出現(xiàn)顯著增高(P<0.05)，其中，200 μg·mL-1瓊膠寡糖處理組SOD活性顯著高于100 μg·mL-1瓊膠寡糖處理組(圖2-A)。與CK相比，CAT活性同樣在處理早期即出現(xiàn)顯著升高，200 μg·mL-1瓊膠寡糖處理組CAT活性在處理4 h時是CK的31.33%，且兩者差異顯著(P<0.05)；100 μg·mL-1瓊膠寡糖處理組CAT活性在處理1 d時較CK升高16.57%(P<0.05)(圖2-B)。PPO活性在100 μg·mL-1瓊膠寡糖處理下均高于CK，其中處理4 h時是CK的2.19倍(P<0.05)(圖2-C)。POD活性變化趨勢不明顯，僅在處理3 d時100 μg·mL-1瓊膠寡糖處理組POD活性較CK升高28.77%(P<0.05)(圖2-D)。不同濃度瓊膠寡糖處理組的MDA含量隨著處理時間的延長不斷下降，在處理5 d時，200 μg·mL-1瓊膠寡糖處理組MDA含量較CK顯著下降了32.13%(P<0.05)(圖2-E)。

2.3 瓊膠寡糖對黃瓜葉片抗性基因幾丁質(zhì)酶與PR1-1a基因相對表達量的影響

由圖3-A可知，幾丁質(zhì)酶基因在100 μg·mL-1瓊膠寡糖處理時做出迅速響應(yīng)，處理4 h時是CK的4.2倍(P<0.01)，但隨后下降。而200 μg·mL-1處理組在處理1 d時做出強烈響應(yīng)，其表達量達到CK的10.4倍(P<0.01)，隨后也降低。由圖3-B可知，PR1-1a基因在處理1 d時表達最顯著，其中100 μg·mL-1瓊膠寡糖處理組的響應(yīng)更明顯，是CK的14.5倍(P<0.01)，隨后都出現(xiàn)降低趨勢。

2.4 瓊膠寡糖對黃瓜啶蟲脒殘留量的影響

由圖4可知，在黃瓜噴施瓊膠寡糖溶液后，農(nóng)藥殘留量隨著時間的延長逐漸減少，殘留消解動態(tài)過程符合一級動力學(xué)方程。啶蟲脒在CK的消解方程為：Ct=0.475 9e-0.165 7t，半衰期為4.2 d；100 μg·mL-1處理組的消解式為：Ct=0.405 4e-0.183 3t，半衰期為3.9 d；200 μg·mL-1處理組的消解式為：Ct=0.331 8e-0.226 1t，半衰期為3.0 d。由此可知，瓊膠寡糖使啶蟲脒的消解半衰期減短，其中200 μg·mL-1瓊膠寡糖處理下第1天與第5天的啶蟲脒含量較CK分別顯著下降34.35%和48.46%(P<0.05)，且200 μg·mL-1瓊膠寡糖處理組較100 μg·mL-1瓊膠寡處理組的降低農(nóng)藥殘留的效果好。

2.5 瓊膠寡糖浸果對黃瓜啶蟲脒殘留的影響

瓊膠寡糖對黃瓜浸果后的農(nóng)殘結(jié)果顯示，黃瓜上啶蟲脒的初始?xì)埩糁禐?.18 ± 0.06 mg·kg-1，經(jīng)過清水浸泡30 min后，減少了36%(P<0.05)；經(jīng)100 μg·mL-1瓊膠寡糖浸泡30 min后減少68.29%(P<0.01)；經(jīng)200 μg·mL-1瓊膠寡糖浸泡后減少61.43%(P<0.01)。由此可見，100 μg·mL-1瓊膠寡糖浸泡黃瓜降低農(nóng)藥殘留的效果更佳。

注：不同小寫字母表示不同處理下差異顯著(P<0.05)。Note: Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level among different treatments.圖2 不同濃度瓊膠寡糖對黃瓜葉片抗氧化酶活性及MDA含量的影響Fig.2 Effects of different concentrations of agar oligosaccharides on antioxidant enzyme activities and MDA contents in cucumber leaves

注：*表示處理間差異顯著(P<0.05)，**表示處理間差異極顯著(P<0.01)。下同。Note: * indicates significant difference between treatments at 0.05 level, and ** indicates extremely significant difference between treatments at 0.01 level. The same as following.圖3 不同濃度瓊膠寡糖處理后幾丁質(zhì)酶(A)和PR1-1a基因(B)的表達變化Fig.3 The expressions of chitinase (A) and PR1-1a genes (B) after cucumbers treated with different concentrations of agar oligosaccharides

圖4 不同濃度瓊膠寡糖溶液對啶蟲脒在黃瓜中的消解曲線影響Fig.4 Effects of different concentrations of agar oligosaccharide solution on the digestion curve of acetamiprid in cucumbers

圖5 不同濃度瓊膠寡糖溶液處理下黃瓜浸果后的農(nóng)藥殘留Fig.5 The pesticide residues of cucumbers after immersed with different concentrations of agar oligosaccharides solution

3 討論

研究表明，寡糖作為一種信號分子[13]具有調(diào)控植物生長發(fā)育、植物激素和酚類化合物含量，刺激植物植保素積累，改變多種酶活性等作用[14-17]。不同結(jié)構(gòu)的寡糖具有不同的作用與功能[18-20]。褐藻寡糖與殼寡糖在這方面的研究應(yīng)用較多。據(jù)報道，褐藻寡糖與殼寡糖具有促進植物發(fā)育、抑制病原菌、緩解脅迫、提高植物抗病的能力[21-25]。但關(guān)于瓊膠寡糖應(yīng)用于農(nóng)業(yè)的研究報道較少。

本研究還發(fā)現(xiàn)，瓊膠寡糖能有效加速黃瓜中啶蟲脒的降解速率，有效減少啶蟲脒的殘留量，能減少60%以上黃瓜農(nóng)藥的殘留，縮短了安全間隔期。陳鵬等[32]研究發(fā)現(xiàn)，某些外源物質(zhì)，如脯氨酸、氯化鈣能夠提高抗氧化酶(POD、CAT)活性，降低番茄葉片中農(nóng)藥殘留量，這與本研究抗氧化酶活性提升，啶蟲脒殘留量減少結(jié)果相一致。而氧化型谷胱甘肽未能提高植株抗氧化酶活性及降低農(nóng)藥殘留，認(rèn)為農(nóng)藥的降解代謝與植物體內(nèi)抗氧化酶反應(yīng)之間存在一定聯(lián)系。此外，本研究首次發(fā)現(xiàn)，采摘后的黃瓜經(jīng)瓊膠寡糖溶液浸泡后，農(nóng)藥殘留也能夠得到顯著降低，這可能是因為寡糖作為激發(fā)子，激活了一系列酶促或非酶促反應(yīng)，促進了啶蟲脒降解為易溶于水的低毒產(chǎn)物[33]，但具體的相關(guān)解毒途徑仍有待進一步深入研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，瓊膠寡糖能夠促進黃瓜植株的生長、提高產(chǎn)量；并通過增加抗氧化酶活、降低MDA積累和誘導(dǎo)病程相關(guān)蛋白基因的表達來提高黃瓜的抗性。此外，噴施和浸泡瓊膠寡糖都能夠減少果實的農(nóng)藥殘留。由此可見，瓊膠寡糖可用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，具有一定的應(yīng)用價值。