張愛民， 邢 丹， 梁傳靜， 牟玉梅， 袁 圓

(貴州省農業(yè)科學院 辣椒研究所， 貴州 貴陽 550006)

木霉菌(Trichodermaspp.)屬于半知菌亞門，絲孢綱、絲孢目、粘孢菌類，廣泛存在于土壤中，除個別為弱病原菌外，大多數對植物病原真菌有拮抗作用，具有廣譜性、廣泛適應性及多機制性等特點[1]。此外，木霉菌還可通過分泌植物生長激素等物質抑制或降解根際有害物質或增加養(yǎng)分利用率，促進植物生長[2-6]。木霉菌作為主要生防菌已被廣泛開發(fā)利用，固體發(fā)酵是擴大生物量，降低生產成本的主要途徑[1]，目前用于木霉菌固體發(fā)酵的原料主要是農作物廢棄物及畜禽糞便[7-12]。蠶桑產業(yè)是貴州省的重要產業(yè)之一，2016年統(tǒng)計表明，貴州省桑園面積約8 000 hm2[13]。2017年蠶桑寫入中央一號文件，加之全省蠶桑產業(yè)的發(fā)展優(yōu)勢[14]，該產業(yè)有迅猛發(fā)展之勢，但該產業(yè)存在的問題是資源利用率偏低，以桑樹為例，每年桑園產生的過剩桑葉約為13 500 kg/hm2[15]，包括夏伐、春伐及不良桑葉的產生等。桑葉中含有大量營養(yǎng)物質，如多糖、蛋白質和有機酸等，在中藥及食品加工中用途廣泛[16]，但利用率低，仍然有大量桑葉被浪費，有研究顯示，用康寧木霉發(fā)酵桑葉可顯著提高飼用桑葉的蛋白質含量、降低粗纖維含量[17]。由此推測，可利用木霉菌產蛋白酶、纖維素酶的特點及桑葉的富含蛋白質和纖維素的特性生產加工有機肥，使過剩桑葉得以合理利用，并尋找合適的木霉菌固體發(fā)酵原料，開拓其應用途徑，提高利用率。為此，研究以篩選的對辣椒疫霉菌具有拮抗作用的木霉菌Tr61為供試菌株，以桑葉為原料制備木霉菌固體發(fā)酵物，探究發(fā)酵物作為有機肥對辣椒種子萌發(fā)及幼苗生長的影響，為該發(fā)酵物的應用研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株 辣椒疫霉菌拮抗木霉菌株Tr61，由貴州省農業(yè)科學院辣椒研究所分離純化保存。

1.1.2 桑葉 桑樹下部老葉，采自貴州省農業(yè)科學院辣椒研究所貴陽試驗基地。

1.1.3 種子 辣研2號(朝天椒)，貴州省農業(yè)科學院辣椒研究所選育品種；茄門甜椒，市購。

1.1.4 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PD)，每升含馬鈴薯浸出粉3 g，葡萄糖13.3 g。

1.1.5 儀器設備 超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、小型液體發(fā)酵罐(5 L)、粉碎機、超聲波清洗儀、高壓滅菌鍋等。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料預處理

1) 木霉菌Tr61液體發(fā)酵。采用小型發(fā)酵罐發(fā)酵，發(fā)酵液為PD。培養(yǎng)條件：28℃，初始pH 5.9，120 r/min，DO160，發(fā)酵7 d。其中一部分混合發(fā)酵液將菌絲打碎，制成固體發(fā)酵菌種，用作固體發(fā)酵；另一部分過濾去菌絲，濾液保存?zhèn)溆谩?/p>

2) 桑葉自然發(fā)酵。采集桑樹下部老葉，自然堆置發(fā)酵，待桑葉完全腐爛變黑為止，收集發(fā)酵過程的滲出液，備用。

3) 木霉菌Tr61桑葉固體發(fā)酵物浸提液的制備。稱取200 g桑葉烘干粉碎、高壓滅菌，加入上述固體發(fā)酵菌種1 000 mL，拌勻，放入淺盤，覆蓋保鮮膜，28℃發(fā)酵15 d。稱取固體發(fā)酵物20 g，加入無菌水200 mL，50℃超聲提取1 h，8層紗布過濾后，再用濾紙過濾，取濾液備用。

1.2.2 浸提液對種子萌發(fā)的影響 試驗設8個處理： 1) 對照(CK1)，無菌水。2) CH，高壓滅菌馬鈴薯葡萄糖(PD)溶液(參比對照)，即PD溶液稀釋10倍，高壓滅菌。3) TF，木霉菌PD發(fā)酵液過濾液用0.2 μm無菌濾膜抽濾后，用無菌水稀釋10倍。4) TH，木霉菌PD發(fā)酵液過濾液稀釋10倍，高壓滅菌。5) MF，桑葉發(fā)酵液抽濾滅菌后稀釋10倍。6) MH，桑葉發(fā)酵液稀釋10倍，高壓滅菌。7) MTF，桑葉發(fā)酵物浸提液濾液抽濾滅菌，稀釋10倍。8)MTH，木霉菌桑葉發(fā)酵物浸提液濾液稀釋10倍，高壓滅菌。

將種子用55℃左右溫水浸種15 min后晾干。在9 cm培養(yǎng)皿中鋪2層滅菌濾紙，每個處理加入相應的溶液10 mL，種子50粒，浸泡24 h后棄去多余的溶液，3次重復。每天觀測記錄發(fā)芽種子數，視濾紙干濕程度加入相應的溶液保持濾紙濕潤。

觀測指標：從開始發(fā)芽起，每天觀察并記錄種子發(fā)芽數，第14天試驗結束；每皿隨機抽取10株測量胚根長、胚軸長，計算發(fā)芽率(GR)、發(fā)芽勢(GP)、發(fā)芽指數(PI)和胚根長/胚軸長。

GR=正常發(fā)芽種子數/供試種子數×100%

GP=第7天供試種子發(fā)芽數/供試種子總數×100%

PI=1.00nd2+0.75nd4+0.5nd6+0.25nd8

式中，nd2、nd4、nd6及nd8分別表示第2天、第4天、第6天和第8天時的種子發(fā)芽率[18]。

1.2.3 木霉菌Tr61固體發(fā)酵物對辣椒幼苗生長的影響 試驗設4個處理：對照(CK2)，純育苗基質；T1，育苗基質+木霉菌桑葉發(fā)酵物，W∶W =10∶1；T2，育苗基質(干重880 g)+木霉菌分生孢子懸浮液1 000 mL(孢子懸浮液濃度為1×106個/mL)；T3，育苗基質+桑葉自然發(fā)酵物，W∶W =10∶1。采用漂浮育苗法育苗，各處理每個品種辣椒播種160粒種子，28℃培養(yǎng)，播種后第20天記錄成苗數，第45天每個處理隨機選取30株測量幼苗莖粗、株高、根長、葉長、葉寬及真葉數等指標。

1.3 數據處理

采用EXCEL進行數據整理并作圖，用SPSS Statistics 17.0進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 木霉菌Tr61桑葉發(fā)酵物浸提液對辣椒種子萌發(fā)的影響

從圖1看出，不同溶液處理辣研2號和茄門甜椒種子的萌發(fā)狀況。

2.1.1 發(fā)芽率 不同溶液處理辣研2號種子的發(fā)芽率依次為MTH(99.33%)>MF(98.67%)=TF(98.67%)>MH(98.00%)=CH(98.00%)>CK1(97.33%)>TH(96.67%)>MTF(96.00%)；茄門甜椒種子的發(fā)芽率依次為MTF(87.33%)=TH(87.33%)>CH(84.67%)>MF(81.33%)>MH(80.67%)>TF(78.67%)>MTH(78.00%)>CK1(77.33%)。相同溶液處理辣研2號種子的發(fā)芽率均較茄門甜椒高。方差分析表明，同一品種辣椒種子的發(fā)芽率各處理間無顯著差異。

2.1.2 發(fā)芽勢 辣研2號種子的發(fā)芽勢以MTH最高，為96.00%；其余處理發(fā)芽勢為MTF(92.00%)>CK1(88.00%)>MH(87.33%)>CH(84.00%)>TH(76.00%)>MF(68.67%)>TF(64.67%)；MTF、MTH與CK1、MH無顯著差異，但二者與其他處理差異顯著；TF的發(fā)芽勢除與MF的差異不顯著外，與其余處理間均存在顯著差異。茄門甜椒種子的發(fā)芽勢為TH(69.33%)>MH(66.00%)>MF(64.67%)>MTF(64.00%)>MTH(61.33%)>CK1(57.33%)>CH(56.00%)>TF(53.33%)。相同溶液處理辣研2號種子的發(fā)芽勢較茄門甜椒高。

2.1.3 發(fā)芽指數 不同處理辣研2號種子發(fā)芽指數的變化趨勢與發(fā)芽勢相似，MTF和MTH的發(fā)芽指數分別為50.43和49.75，除與MH(45.87)、CK1(44.79)間差異不顯著，與其余處理間差異顯著；TF與TH差異不顯著，二者與其余處理間差異顯著。各處理茄門甜椒的發(fā)芽指數變化趨勢與辣研2號相似，在TF處理下最低(19.56)，但各處理間無顯著差異。相同溶液處理辣研2號種子的發(fā)芽指數均較茄門甜椒高。

注：圖中不同小寫字母表示同一品種不同處理間差異顯著(P<0.05)，下同。

Note: Different lowercase letters in the figure indicate significant differences between different treatments in the same variety (P<0.05).The same below.

圖1木霉菌Tr61桑葉發(fā)酵物浸提液處理辣椒種子的萌發(fā)狀況

Fig.1 Germination of pepper seeds treated with extract liquid ofTrichodermaTr61 + mulberry leaf fermentation broth

2.2 木霉菌Tr61桑葉發(fā)酵物及其浸提液對辣椒幼苗生長的影響

2.2.1 胚軸長和胚根長 試驗后期由于茄門甜椒種子及幼苗霉爛較多，未進行胚根長及胚軸長測定。從圖2可知，各處理辣研2號胚根長、胚軸長和胚根長/胚軸長的變化趨勢。各處理胚軸長和胚根長的變化趨勢相似，CH的胚軸長和胚根長最長，分別為3.51 cm和3.53 cm，與MTF(3.39 cm、3.05 cm)差異不顯著，與MTH(2.74 cm、2.72 cm)差異顯著；MTF和MTH的胚軸長分別為3.39 cm和2.74 cm，胚根長分別為3.05 cm和2.72 cm，顯著大于CK1(2.36 cm和1.66 cm)，MTF和MTH的胚軸長分別比CK1提高44.00%和16.10%，胚根長分別高84.00%和64.06%，胚根長/胚軸長分別高29.00%和46.13%。MH和MF間差異不顯著，二者的胚軸長、胚根長和胚根長/胚軸長比值顯著小于其余處理。

2.2.2 種子成苗率 由表1可知，基質中不同的添加物對辣椒種子成苗率均有一定影響，辣研2號和茄門甜椒2個品種的成苗率均以CK2最高，分別為68.75%和69.38%，其中T1比CK2分別降低24.54%和23.42%。辣研2號T1和T3的成苗率相當，略高于T2；茄門甜椒T2和T3的成苗率相當，略高于T1。

圖2 木霉菌Tr61桑葉發(fā)酵物浸提液處理辣研2號幼苗種胚的生長狀況

表1木霉菌Tr61發(fā)酵物處理辣椒種子的成苗率

Table 1 Seedling rate of pepper seeds treated withTrichodermaTr61 fermentation product

處理Treatment辣研2號Layan 2苗數/株成苗率/%茄門甜椒Sweet pepper苗數/株成苗率/%CK211068.7511169.38 T1 8351.88 8553.13 T2 7546.88 10364.38 T3 8855.0010867.50

2.2.3 幼苗農藝性狀 從表2可知，添加不同物質的育苗基質對辣椒幼苗農藝性狀的影響存在一定差異。

1) 莖粗。辣研2號幼苗莖粗CK2最小，與其余各處理間差異顯著，T1比CK2提高30.89%；T3莖粗最大，平均直徑為1.78 cm，與T1和T2差異顯著，說明育苗基質+桑葉自然發(fā)酵物有利于辣研2號幼苗生長。茄門甜椒的變化與辣研2號相似，CK2幼苗莖粗最小，其余各處理的莖粗平均值均為1.54 cm，與CK2差異顯著，其中T1比CK2提高11.59%。說明，育苗基質+木霉菌桑葉發(fā)酵物，育苗基質(干重880 g)+木霉菌分生孢子懸浮液1 000 mL以及育苗基質+桑葉自然發(fā)酵物均可促進茄門甜椒幼苗生長。

2) 株高。辣研2號和茄門甜椒均以T1幼苗的株高最高，分別為11.19 cm和8.71 cm，分別比CK2提高58.72%和61.90%，較同一品種其余處理差異顯著；T3其次，為10.54 cm和7.92 cm；CK2最低，為7.05 cm和5.38 cm。說明，育苗基質+木霉菌桑葉自然發(fā)酵物有利于2種辣椒幼苗株高增高。

表2 木霉菌Tr61發(fā)酵物處理辣椒幼苗的生長情況

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note:Different lowercase letters indicate significant difference atP<0.05 level.

3) 根長。辣研2號的根長依次為T3(8.45 cm)>T1(6.56 cm)>CK2(4.93 cm)>T2(3.65 cm)，T3與其余處理間差異顯著；T1比CK2提高33.06%，顯著高于CK和T2。茄門甜椒的根長依次為CK2>T2>T1>T3，CK2和其余處理間差異顯著，其中，T1比CK2下降39.62%，但其余3個處理間差異不顯著。

4) 葉長和葉寬。2個品種的葉長和葉寬變化趨勢相似。辣研2號的葉長和葉寬為T3>T2>T1>CK2，T3與其余處理間存在顯著差異。茄門甜椒均表現為T2>T3>CK2>T1，T2與其余處理間存在顯著差異。說明，育苗基質+桑葉自然發(fā)酵物有利于辣研2號葉的生長，而育苗基質(干重880 g)+木霉菌分生孢子懸浮液1 000 mL有利于茄門甜椒葉的生長。

5) 真葉數。辣研2號的真葉數依次為T3(9.43片)>T2(7.70片)>CK2(7.57片)>T1(7片)，T3和CK2分別與其余處理差異顯著。茄門甜椒的真葉數依次為CK2(5.73片)>T1(5.30片)=T2(5.30片)>T3(5.00片)，CK2與其余處理間差異顯著。

3 結論與討論

3.1 木霉菌Tr61桑葉發(fā)酵物浸提液對種子萌發(fā)的促進作用

發(fā)芽率反映種子的生活力，發(fā)芽勢主要體現種子的發(fā)芽速率和整齊度，發(fā)芽指數則是反映種子的萌發(fā)速率和整齊度的另一個重要指標。研究結果表明，各溶液處理2個辣椒品種種子的發(fā)芽率較清水對照(CK1)的變化不顯著，說明，木霉菌發(fā)酵液、桑葉自然發(fā)酵浸提液和木霉菌桑葉發(fā)酵物浸提液對辣椒種子的生活力沒有影響；各溶液處理辣研2號種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽指數出現顯著差異，2個指標均以TF(抽濾滅菌木霉菌發(fā)酵液)最低，并且顯著低于CH(高壓滅菌PD溶液)，說明溶液中的葡萄糖并不是影響種子萌發(fā)的重要因素，而可能是木霉菌在發(fā)酵過程中產生了對種子萌發(fā)有抑制作用的物質。MTF和MTH(高壓滅菌木霉菌桑葉發(fā)酵物浸提液)的種子發(fā)芽勢與發(fā)芽指數均高于其余處理，可能是因為木霉菌桑葉發(fā)酵的產物中存在能夠促進種子萌發(fā)的物質。整體看，茄門甜椒的種子發(fā)芽狀況較辣研2號差，其發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數均明顯低于辣研2號，且3個指標在各處理間均無顯著變化，可能與辣椒種子質量有關，種子生活力較差的情況下，生長促進或抑制物對該種子的萌發(fā)無明顯作用。

不同溶液對辣研2號種子萌發(fā)后胚根和胚軸生長的影響存在顯著差異。其中，MH(高壓滅菌桑葉發(fā)酵液)和MF胚根和胚軸長均低于CK1，三者間差異不顯著，但三者均低于其余各處理；MH和MF低于CK1可能是因為浸提液中的某些物質抑制了培根和胚軸的生長。MTF和MTH的胚根長和胚軸長顯著高于MH和MF，可能是因為木霉菌發(fā)酵桑葉過程中消耗了對幼苗生長有抑制作用的物質。CH與TH(高壓滅菌木霉菌PD發(fā)酵液)、TF的胚軸長和胚根長均較高，可能與溶液中含有一定量的葡萄糖有關。

總之，當種子具有較好的生活力時，木霉菌桑葉發(fā)酵物的浸提液有利于提高種子萌發(fā)的整齊度，并且對胚根和胚軸生長具有一定的促進作用，其作用均優(yōu)于木霉菌液體發(fā)酵液或桑葉自然發(fā)酵物的浸提液。說明，桑葉可以作為木霉菌發(fā)酵的原材料，可用于生產木霉菌生物有機肥，也可為桑葉的有效利用提供一條新途徑。

3.2 木霉菌Tr61桑葉發(fā)酵物對辣椒幼苗生長的促進作用

育苗基質中添加其他物質均使辣椒成苗率有所降低，原因可能是發(fā)酵產物中的物質對種子萌發(fā)有一定抑制作用。其中，基質+木霉菌桑葉發(fā)酵物與基質+木霉菌分生孢子懸浮液處理的種子成苗率較其余2個處理的成苗率低，結合發(fā)酵物浸提液對辣椒種子萌發(fā)試驗中TH和TF對辣椒種子發(fā)芽勢和發(fā)芽指數的影響看，木霉菌對種子萌發(fā)產生抑制作用的可能性較大。

育苗基質中添加其他物質各處理的其他測定指標較純育苗基質(CK2)均有一定的提升，尤其是莖粗和株高，3個處理的測定值均高于CK2，說明在幼苗生長后期，不同的添加物可能發(fā)揮了一定效用，促進了幼苗地上部分的生長，尤其是真葉數的增加。說明，在相同時間內，桑葉自然發(fā)酵物的添加可能對縮短苗齡，促進幼苗快速生長有一定作用。

研究結果表明，木霉菌或桑葉發(fā)酵物對辣椒種子萌發(fā)可能有一定的抑制作用，而對幼苗生長具有一定的促進作用，產生該現象的原因可能是發(fā)酵物中存在抑制種子萌發(fā)和促進幼苗生長的物質，也可能是有機物添加過多造成了燒苗現象。因此，有機物的添加比例和添加時期還有待于進一步研究。