喻日成， 范元碩， 羅建華

(貴州省人民醫(yī)院 內分泌科， 貴州 貴陽 550002)

脂肪組織在能量的代謝中具有起重要作用，白色脂肪組織儲存甘油三酯、通過脂解后提供脂肪酸，棕色脂肪組織通過激活解偶聯(lián)蛋白-1(UCP-1)及線粒體β氧化分解脂肪酸提供熱量[1-2]。UCP-1、過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助因子(PGC-1α)在棕色脂肪組織中表達豐富，可作為輔助因子與過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)和甲狀腺受體β(TRβ)結合、并作用于UCP-1啟動子，與肥胖的發(fā)生關系密切[3-4]。現(xiàn)代藥理研究表明，鹽酸小檗堿不僅具有解熱、抗炎的作用，還具有改善胰島素抵抗的作用[5-6]。目前鹽酸小檗堿改善胰島素抵抗的機制尚不明確，本研究觀察鹽酸小檗堿對肥胖大鼠棕色脂肪組織形態(tài)及功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

6周齡Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠24只，初始體質量70～80 g，中南大學湘雅醫(yī)學院動物中心提供；RNA提取試劑盒(QIAGEN)，逆轉錄試劑盒(Applied Biosystems)， LightCycler?TaqMan?Master(Roche)，UCP-1一抗(Santa Cruz)，PGC-1α一抗(acam)，辣根過氧化物酶 (HRP) 標記的二抗(nta Cruz)。

1.2 方法

1.2.1分組 SD雄性大鼠隨機分為對照組、高脂喂養(yǎng)組及鹽酸小檗堿組，每組8只。對照組大鼠喂基礎飼料(蛋白質22%，脂肪12%，碳水化合物66%)、高脂喂養(yǎng)組和鹽酸小檗堿組大鼠喂高脂飼料(蛋白質9%，脂肪66%，碳水化合物25%)，6周后鹽酸小檗堿組加入200 mg/(kg·d)鹽酸小檗堿灌胃，均喂養(yǎng)24周，乙醚麻醉后斷頭處死，取肩胛部位的棕色脂肪組織保存于-80 ℃用于后續(xù)研究，每組取4只大鼠肩胛部位棕色脂肪組織用4%多聚甲醛固定、行常規(guī)HE染色。

1.2.2UCP-1 及PGC-1α mRNA表達 (1)總RNA制備，取-80 ℃保存的棕色脂肪組織剪碎，加入TRIzol 1 mL充分勻漿，按QIAGEN試劑盒說明書介紹的方法提取總RNA，采用Nanodrop ND1000 測定RNA的濃度。(2)cDNA合成，按逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA，每個反應體系含RNA 1 μg、10×RT緩沖液2 μL、 dNTP 0.8 μL、隨機引物2 μL、逆轉錄酶1 μL，總反應體系20 μL；反應條件25 ℃ 10 min，37 ℃ 120 min，85 ℃ 5 min，4 ℃后取出樣品，-20 ℃保存。(3)PCR擴增，PCR總反應體系10 μL，含cDNA模板2 μL、TaqMan?Master 5 μL、ddH2O 2.5 μL、引物0.5 μL(序列見表1)。PCR反應條件95 ℃ 10 min,95 ℃ 10 s、60 ℃ 1 min、72 ℃ 20 s，40個循環(huán)， 72 ℃ 5 min。每個qPCR重復3次，以GAPDH作為內參照基因，目的基因的相對表達量通過公式2-ΔΔCt計算。

表1 Real-time PCR引物Tab.1 Real-time PCR primers

1.2.3UCP-1、PGC-1α蛋白表達 (1)大鼠棕色脂肪組織總蛋白提取，取-80 ℃保存的大鼠棕色脂肪組織適量，加入RIPA裂解液1 mL，充分勻漿后提取總蛋白，通過BCA方法測量蛋白濃度。(2)檢測UCP-1、PGC-1α蛋白表達，將蛋白樣品40 μg加入10% SDS-PAGE點樣孔，100 V電壓電泳2 h，凝膠轉PVDF膜，5%的脫脂牛奶封閉，UCP-1、PGC-1α及β-actin一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗3次，加辣根過氧化物酶酶標記的二抗常溫下30 min，TBST洗3次；化學發(fā)光法顯影、定影，將膠片進行掃描拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標帶的分子量和凈光密度值。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 大鼠肩胛棕色脂肪組織HE染色

光鏡下可見對照組大鼠肩胛間棕色脂肪組織內的細胞小而均勻，高脂喂養(yǎng)組大鼠棕色脂肪組織內的細胞大小不一，結構紊亂，鹽酸小檗堿組的棕色脂肪細胞排列較高脂喂養(yǎng)組整齊，細胞大小較均勻。見圖1。

2.2 大鼠肩胛棕色脂肪組織UCP-1、PGC-1α基因表達

Real Time RT-PCR及Western Blot結果顯示，高脂喂養(yǎng)組大鼠肩胛棕色脂肪組織UCP-1、PGC-1α基因表達水平顯著低于對照組，而鹽酸小檗堿組UCP-1、PGC-1α基因表達水平較高脂模型組明顯上調(P<0.05)。見圖2。

對照組 高脂喂養(yǎng)組 鹽酸小檗堿組圖1 各組大鼠肩胛棕色脂肪組織學(HE，×400)Fig.1 HE staining of scapula brown adipose tissue of rats each group under light microscope

注：1為對照組，2為高脂喂養(yǎng)組，3為鹽酸小檗堿組；(1)與對照組比較P<0.05，(2)與高脂喂養(yǎng)組比較P<0.05。圖2 大鼠肩胛棕色脂肪組織UCP-1、PGC-1α基因表達Fig.2 Expression of UCP-1 and PGC-1α genes in brown adipose tissue of scapula in rats

3 討論

肥胖的發(fā)病機制復雜，研究發(fā)現(xiàn)脂肪組織的功能與肥胖的發(fā)生密切相關。棕色脂肪組織由棕色脂肪細胞及血管構成，含有豐富的線粒體，受交感神經支配，既往認為人類的棕色脂肪組織只存在新生兒階段，但新近研究發(fā)現(xiàn)在成年人中亦存在有功能的棕色脂肪組織[7]。棕色脂肪組織線粒體內膜上UCP-1表達豐富，通過氧化脂肪酸產熱，在寒冷環(huán)境中維持體溫、或消耗機體攝取的過多能量，維持體內能量代謝平衡[8-9]。PGC-1α是能量代謝途徑中眾多轉錄因子的共激活因子，能誘導棕色脂肪組織中UCP-1的高表達[10]。本研究結果表明，高脂喂養(yǎng)的大鼠肩胛部位的棕色脂肪組織的結構發(fā)生明顯的改變，細胞大小不一、排解紊亂，而且高脂喂養(yǎng)的大鼠肩胛部位的脂肪組織UCP-1、PGC-1αmRNA和UCP-1、PGC-1α蛋白表達明顯下調，因此推測棕色脂肪組織的結構及功能的改變與大鼠的肥胖發(fā)生相關。

有研究表明，UCP-1基因敲除小鼠易發(fā)生高脂飲食誘導的肥胖、并出現(xiàn)肥胖相關代謝紊亂如胰島素抵抗和高脂血癥[11]?，F(xiàn)代藥理研究表明小檗堿具有改善胰島素抵抗、糾正脂質紊亂，促進胰島素分泌等作用，認為小檗堿可能通過調節(jié)類固醇結合元件結合蛋白、PPAR-γ等基因的轉錄從而改善糖尿病倉鼠的胰島素抵抗[12]，還有研究發(fā)現(xiàn)小檗堿能激活能量代謝感應器AMPK，啟動脂肪酸氧化和糖酵解，改善胰島素抵抗[13]；亦有認為UCP-1、PGC-1α基因的表達增加與能量消耗密切相關[14]。目前國內外尚未見有關小檗堿對棕色脂肪組織UCP-1、PGC-1α基因的表達影響的相關報道，本研究結果發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿能改善高脂喂養(yǎng)大鼠肩胛棕色脂肪組織的結構紊亂，推測這種改變可能與鹽酸小檗堿提高大鼠肩胛棕色脂肪組織UCP-1、PGC-1α的表達有關，但其具體機制有待于進一步的研究。

綜上，鹽酸小檗堿具有抗炎，調節(jié)能量代謝，糾正脂代謝紊亂等多重作用，其通過影響肥胖大鼠棕色脂肪組織的結構及功能改善肥胖大鼠的胰島素抵抗，為其在臨床中的應用提供了一定的理論依據。