羅華灶 李 雪 依 含 謝 君 朱乃碩

(復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物感染與分子免疫學(xué)實驗室，上海200438)

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是常見的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率目前全球排名第四，死亡率高居第五位[1]。預(yù)計2030年，CRC病例將增加60%，新病例達到220萬，死亡人數(shù)達110萬[2]。其主要治療方式為手術(shù)，但惡性程度高，術(shù)后易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，近年來興起的免疫療法正掀起腫瘤治療的革命[3,4]。小鼠由于與人類存在可比較的基因組大小，繁殖周期短，產(chǎn)仔數(shù)大，實驗成本低且易于操作[5]，因此小鼠模型仍然是藥物發(fā)現(xiàn)和新興療法的臨床前評估的主要支柱[6,7]。開發(fā)用于研究的腫瘤異種移植動物模型的主要目的是聯(lián)系基礎(chǔ)和臨床研究，也是對體外模型系統(tǒng)運用的很好補充[8]。結(jié)腸癌動物模型的建立是研究結(jié)腸癌體內(nèi)發(fā)生、進展、侵襲轉(zhuǎn)移及免疫治療PD-L1抗腫瘤藥物效果評估的重要手段[9]。盡管已有學(xué)者利用生物發(fā)光成像技術(shù)建立腫瘤移植模型，但諸多小鼠腫瘤模型尚缺乏動態(tài)連續(xù)追蹤及量化分析[10]。理想的小鼠模型將一致地模擬人CRC的進展，應(yīng)該在整個結(jié)腸和直腸中自發(fā)發(fā)展，在潛伏期短的動物中具有高發(fā)病率，遵循相同的轉(zhuǎn)移模式，在具有免疫能力的動物中發(fā)生轉(zhuǎn)移，允許無創(chuàng)監(jiān)測疾病進展并具有相同的人類疾病分子特征[10]。目前的動物模型不能滿足所有這些要求，但隨著先進的成像模式，許多細胞系和先進的轉(zhuǎn)基因建模方法可供選擇。慢病毒可將目的外源基因整合進靶細胞基因組，實現(xiàn)靶細胞長期而穩(wěn)定表達目的基因[11,12]，因此本研究采用三質(zhì)粒慢病毒系統(tǒng)建立穩(wěn)定整合及表達螢火蟲熒光素酶基因的結(jié)腸癌細胞株，進行體外生長特性和PD-L1表達量的分析，并進行BALB/c鼠皮下移植瘤模型的構(gòu)建，運用活體成像系統(tǒng)進行整體動態(tài)觀察，從而為研究結(jié)腸癌的發(fā)生、進展機制及判斷藥物治療效果提供全新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物及環(huán)境 CT26細胞和293T細胞購自上海中科院細胞庫。BALB/c雌性小鼠，購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，體重15～20 g，鼠齡 5～8周，飼養(yǎng)在復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動物房平臺SPF環(huán)境，按實驗動物使用的“3R”原則給予動物人道的關(guān)懷。

1.1.2試劑與設(shè)備 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素和PBS購于Thermo公司；LipoFiterTM試劑購自漢恒生物；Polybrene、TritonTMX-100及PI染液購于Sigma；Puromycin購于Gibco；TransDetect Single-luciferase(Firefly)Reporter Assay Kit購于全式金；Luciferase Assay System，Luciferin(In vivo Grade)購自Promega公司；戊巴比妥鈉購于德國默克公司；CCK-8試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；BV421 Rat Anti-Mouse CD274(PD-L1)，BV421 Rat IgG2a λ Isotype Control，BD FACS Stain Buffer(FBS)購自BD；流式細胞儀Beckman Gallios 3L 10C，細胞計數(shù)儀Z2 coulter購自美國Beckman Coulter公司；Calibur流式細胞儀購自BD Pharmingen公司。倒置熒光顯微鏡購于德國Carl Zeiss公司；熒光素酶檢測系統(tǒng)(GLOMAX 96 micro plate luminometer)購于Promega公司；活體成像系統(tǒng)(Night OWLⅡ LB983 NC100)購于德國Berthold公司。

1.2方法

1.2.1慢病毒的生產(chǎn) 轉(zhuǎn)染前1 d將布滿培養(yǎng)皿50%以上的293T細胞接種于24孔板中，轉(zhuǎn)染時將完全培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基。將3質(zhì)粒(psPAX2，pMD2.G以及pHBLVTM)與LipoFiterTM試劑按1∶1體積比混勻后加入293T細胞中，培養(yǎng)6～12 h，去除含LipoFiterTM-DNA的無血清培養(yǎng)基，并換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h，超速離心后取病毒上清，0.45 μm濾膜過濾，收集慢病毒原液，-80℃保存。

1.2.2感染及穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的篩選 將生長狀態(tài)良好的結(jié)腸癌細胞稀釋至細胞密度為1.5×105ml-1接種于6孔板，每孔接種體積為2 ml，使得第二天細胞布滿培養(yǎng)皿約60%左右，用收集的慢病毒感染細胞，感染時棄原有培養(yǎng)基，添加含5%FBS的新鮮培養(yǎng)液2 ml，按MOI=3的比例用慢病毒感染，并添加polybrene使得其最終濃度為7 g/ml。3 d后加12 g/ml 嘌呤霉素篩選。

1.2.3篩選細胞的放大培養(yǎng) Puromycin篩完兩代的存活率較好的細胞株，檢測有過表達LUC則安排大量擴增細胞，待細胞長滿后進行凍存，凍存細胞株后需進行復(fù)蘇驗證。

1.2.4CT26-LUC-1細胞株LUC活性檢測

1.2.4.1CT26-LUC-1細胞克隆體外熒光值檢測 細胞建株成功后檢測熒光素酶活性。檢測時，按1×104個/50 μl 細胞裂解液(Cell lysis buffer)裂解10 min，12 000 r/min，4℃離心10 min取上清；取 40 μl 細胞裂解液(即上述上清)放入黑色不透光96孔板；檢測時每孔加入90 μl Luciferase Reaction Reagent工作液；移液槍吹打混勻2～3次，測定記錄Luciferase值，設(shè)3個復(fù)孔；同時設(shè)置CT26-WT對照。

1.2.4.2不同數(shù)量的細胞克隆體外成像檢測 將篩出的熒光素酶表達細胞株定名為CT26-LUC1細胞株，將CT26-LUC1細胞按細胞數(shù)5×105、2.5×105、1.25×105、6.25×104、3.12×104、1.56×104個分別接種到96孔黑板中，將未帶熒光標記的CT26-WT細胞以相同的稀釋倍數(shù)作為對照。另外設(shè)置2個復(fù)孔僅含培養(yǎng)基作為對照，培養(yǎng)貼壁后小心去掉上清，PBS洗一次，每孔加入100 μl PBS，再加入終濃度為150 μg/ml的D-Luciferin，孵育15 min后用活體成像系統(tǒng)檢測，以每秒光子量(ph/s)表示，采用一元線性回歸法分析熒光信號強度與細胞數(shù)之間的相關(guān)性。

1.2.5CT26-LUC1細胞與CT26-WT細胞生物學(xué)特性的比較

1.2.5.1細胞生長曲線 取生長狀態(tài)良好的CT26-LUC1細胞和CT26-WT 細胞，接種于24孔板，接種密度為2×104個/孔。細胞接種后第1天到第7天，胰蛋白酶每天消化其中3孔細胞，用細胞計數(shù)儀Z2 coulter測定細胞數(shù)，繪制兩種細胞生長曲線。

1.2.5.2CCK-8細胞增殖實驗 將生長狀態(tài)良好的CT26-LUC1細胞和CT26-WT細胞接種于96孔板中(2 000個/孔)，每孔含100 μl培養(yǎng)基。鋪板后第1、2、3、4天每孔加入10 μl的CCK-8溶液，37℃孵育2～3 h后用酶標儀測定其OD450值，繪制增殖曲線。

1.2.5.3細胞周期檢測 取生長狀態(tài)良好的CT26-LUC1細胞和CT26-WT細胞，0.25%胰酶消化，離心棄上清液，PBS洗后加入PBS稀釋的0.03% TritonTMX-100固定穿孔15 min后，將細胞離心棄Trixon 100后用PBS洗兩次，加入PI染液，室溫避光孵育15 min后，使用Calibur流式細胞儀檢測，Modfit軟件進行周期分析。

1.2.5.4表面PD-L1的流式分析 收集對數(shù)生長期的細胞，將100 μl FACS Stain Buffer中1×106個細胞與BV421 Rat Anti-Mouse PD-L1和BV421 Rat IgG2a λ Isotype Control同種型對照抗體在冰上避光孵育30 min后，將細胞重懸于500 μl FACS染色緩沖液中。使用Beckman Gallios 3L 10C儀器進行收集細胞，并使用FlowJo_V10軟件分析結(jié)果。

1.2.6體內(nèi)結(jié)腸癌模型的建立及生物發(fā)光活體成像 BALB/c鼠，5～6周齡，體重(15± 5)g。取對數(shù)生長期的CT26-LUC1克隆細胞，用PBS重懸為2.5×106ml-1，BALB/c鼠右背側(cè)近腋部皮下接種200 μl。同時接種CT26-WT作為對照去除生物發(fā)光背景。接種后第7天采用活體成像系統(tǒng)檢測信號強度。觀測前BALB/c鼠先按150 mg/kg體重的量腹腔注射Luciferin，反應(yīng)約5 min后腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉(50 mg/kg)，活體成像觀察皮下腫瘤的熒光強度，觀察并記錄小鼠的生長狀態(tài)。

1.2.7病理形態(tài)學(xué)觀察 CT26-LUC1細胞BALB/c鼠皮下接種15 d后處死小鼠，取腫瘤組織，制成石蠟切片，切片方向為最大截面，厚度為3 μm，經(jīng)HE染色后觀察細胞的病理形態(tài)學(xué)，同時對CT26-WT細胞接種的皮下移植瘤進行HE染色觀察。

2 結(jié)果

2.1篩選細胞的擴增培養(yǎng)的復(fù)蘇驗證 嘌呤霉素篩完兩代的細胞株存活率均較好，檢測有過表達LUC則安排大量擴增細胞，凍存細胞株后進行復(fù)蘇驗證，同野生型CT26細胞(圖1A)對比，CT26-LUC1細胞系生長形態(tài)和狀態(tài)良好，細胞存活率高且無污染，未見顯著變化(圖1B)。

2.2CT26-LUC1細胞體外熒光素酶(Luciferase)活性的檢測和評估 經(jīng)過嘌呤霉素篩選6 d后，進行CT26細胞體外熒光素酶(Luciferase)活性的檢測，細胞懸液按1×104cell/50 μl細胞量濃度進行裂解后，發(fā)光強度為1.43×107，極顯著高于CT26-WT細胞(圖2A)。CT26-LUC1細胞在96孔板中經(jīng)倍比稀釋后， 熒光強度與細胞數(shù)呈現(xiàn)良好的相關(guān)性(R2=0.972 6)(圖2B、C)。可見已獲得能夠穩(wěn)定表達熒光素酶的結(jié)腸癌細胞株CT26-LUC1。

2.3CT26-LUC-1細胞模型的檢測靈敏度 體外用活體成像系統(tǒng)Night OWLⅡ LB983 NC100可檢測細胞數(shù)約為15 000個(圖2A)。而CT26-LUC1細胞株在BALB/c小鼠體內(nèi)接種2 d后，腫瘤體積約為3 mm3即可檢測到熒光素酶信號(圖2D)。

2.4穩(wěn)定表達熒光素酶的CT26細胞系的生長特性及膜型PD-L1表達量 兩種細胞CT26-WT與CT26-LUC1，所繪制的生長曲線基本重合，CT26-WT僅在第2天至第3天生長較CT26-LUC1生長稍快，最后在第5天后生長趨勢趨向一致(圖3A)，總體生長增殖能力差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。類似生長趨勢在CCK-8法繪制的細胞生長曲線中，在4 d的生長周期中，CT26-LUC1細胞與CT26-WT細胞生長趨勢基本一致(圖3B)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。表明通過慢病毒感染的方法轉(zhuǎn)染熒光素酶基因到細胞的過程中，并未對細胞本身的生長特性產(chǎn)生影響。CT26-LUC1組與CT26-WT均以G0/G1期細胞為主，各期細胞數(shù)未見顯著性差異(P>0.05)(圖3C)。而CT26結(jié)腸癌模型是腫瘤免疫應(yīng)用于免疫檢查點PD-1/PD-L1信號通路研究的常用腫瘤模型，其PD-L1的表達量是關(guān)注的重點，CT26-LUC1組與對照組細胞的PD-L1百分比分別為16.07±0.34、15.53± 0.40，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖3D)。

2.5結(jié)腸癌皮下移植瘤模型的活體成像評估及腫瘤組織病理學(xué)觀察 兩組各3只BALB/c小鼠都成功接種成功，接種CT26-LUC1的小鼠與接種CT26-WT的小鼠相比，小鼠體重、活動情況、進食量及外表體征等均無不良影響，皮下荷瘤小鼠存活期長，接種CT26-LUC1的小鼠與接種CT26-WT的小鼠在15 d 觀察期中體重呈小幅增長的趨勢，且無顯著性差異(圖4A)。5×105個CT26-LUC1細胞皮下接種BALB/c鼠，成瘤率為100%。在接種第5天才能發(fā)現(xiàn)明顯的腫塊，但在接種CT26-LUC1細胞2 d后，活體成像系統(tǒng)即可檢測到皮下較強的熒光信號，到第7天出現(xiàn)凸起的腫塊時，熒光強度為2.4×104ph/s，而到腫瘤接種21 d后，中晚期腫瘤熒光強度為5.2×104ph/s，與早期腫瘤相比熒光強度已成倍增加(圖4B)，腫瘤大小與熒光成像呈現(xiàn)很好的關(guān)系，并且能夠發(fā)現(xiàn)腫瘤已經(jīng)從接種部位轉(zhuǎn)移至四周，說明穩(wěn)定表達熒光素酶報告基因的鼠CT26-LUC1細胞從接種開始就能很好地反映腫瘤的生長，由此成功建立熒光素酶標記的小鼠結(jié)腸癌細胞活體成像移植瘤模型。CT26-LUC1細胞移植瘤鏡下癌細胞排列呈團索狀，大小形態(tài)各異，胞漿豐富，細胞核大深染，局部未染色可見壞死。與CT26-WT對照細胞沒有差別(圖4C)，符合結(jié)腸癌組織細胞特征，可見慢病毒轉(zhuǎn)染熒光素酶基因?qū)δ[瘤細胞組織形態(tài)學(xué)無顯著影響。

圖1 CT26細胞系中穩(wěn)定過表達LUC的細胞株擴增培養(yǎng)后復(fù)蘇驗證(×100)Fig.1 Confirmation of resuscitation after expansion of CT26 cell line stably overexpressing LUC(×100)Note: A.CT26-WT；B.CT26-LUC1.

圖2 CT26-LUC1細胞克隆體外熒光活性檢測Fig.2 CT26-LUC1 cell clone in vitro fluorescence acti-vity assayNote: A.Detection of luciferase fluorescence in vitro of CT26 cells imaging of different numbers of CT26-LUC1 live cells in vitro；C.Detection sensitivity of CT26-LUC1 cell line in BALB/c mice；D.Correlation analysis of luminescence signal intensity and cell number.***.P<0.001.

圖3 CT26-LUC1細胞與CT26-WT細胞生長特性的比較Fig.3 Comparison of growth characteristics between CT26-LUC1 cells and CT26-WT cells Note: A.Comparison of cell proliferation curves between two groups (cells counting method)；B.Comparison of cell proliferation curves between two groups (CCK-8 method)；C.Detection of cell cycle distribution between the two groups；D.Detection of cell membrane type PD-L1 expression between the two groups；NS.Not significant.

圖4 CT26-LUC1組與CT26-WT組BALB/c鼠皮下移植模型活體成像及病理檢測Fig.4 In vivo images and histopathological detection of BALB/c mouse subcutaneous transplantation model of colon in CT26-LUC1Note: A.Mouse weight vivo imaging to detect the growth of subcutaneously inoculated CT26-LUC1 cells in BALB/c mouse；C.HE staining result of tumor tissue (×400)；NS.Not significant.

3 討論

運用試驗動物建立腫瘤模型可模擬活體狀態(tài)下疾病的特征，為癌癥的診療和抗腫瘤藥物的研究提供試驗材料[13]。既往動物實驗實行人為肉眼觀察、腫瘤稱重、體積測量及組織切片病理觀察，導(dǎo)致研究缺乏精確定量性、活體觀察和整體性[14]，并且存在動物倫理學(xué)、實驗誤差及無法連續(xù)動態(tài)觀察等諸多弊端[15]。生物發(fā)光成像技術(shù)是近年開發(fā)的一種直接測量活體動物中生物發(fā)光信號的新技術(shù)，實現(xiàn)了對小動物腫瘤模型實時、連續(xù)及非侵入性觀察，能夠在整體水平上動態(tài)監(jiān)測動物中的腫瘤細胞生長、轉(zhuǎn)移等情況[16-18]。理想的移植性腫瘤動物模型應(yīng)該具有高重復(fù)性、高成瘤成功率及穩(wěn)定的特點[19]。

CRC是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，其發(fā)病率和死亡率每年以3 %～4 %速度上升[20]。目前結(jié)直腸癌仍首推外科治療，但是近年推崇的以PD-1/PD-L1為代表的免疫治療在腫瘤治療中展現(xiàn)了極其重要的作用，抑制/下調(diào) PD-1/PD-L1信號通路能夠有效提高對多種腫瘤的抗瘤效果[21，22]，尤其對結(jié)直腸癌效果更佳[23]，PD-1/PD-L1檢查點抑制劑在dMMR(錯配基因修復(fù)缺陷)結(jié)直腸癌患者中表現(xiàn)出治療活性，而約95%的微衛(wèi)星穩(wěn)定性(Microsatellite stability，MSS)結(jié)腸癌患者中單獨使用此類抑制劑時療效甚微，但一項Atezolizumab聯(lián)合MEK抑制劑Cobimetinib治療MSS亞型的(非錯配基因修復(fù)缺陷)結(jié)直腸的Ⅰ期臨床試驗被認為給不適合免疫治療的結(jié)直腸癌患者帶來了希望[24]。免疫治療極大地改善了患者的生存質(zhì)量和減少病患的痛苦及長期化療放療帶來的身體傷害[25]，目前也正在探索奧沙利鉑(OXA)聯(lián)合PD-1/PD-L1抗體治療CRC[26，27]。

當(dāng)前致癌物誘導(dǎo)和基因工程小鼠模型在CRC發(fā)展和化學(xué)預(yù)防的研究中最有前景，而腫瘤移植模型適用于篩選候選治療劑，皮下移植瘤用于在原位模型中的后續(xù)驗證藥物的高通量評估[10]，為每個實驗應(yīng)用選擇最合適的動物模型，轉(zhuǎn)化為與人體治療CRC相似的結(jié)果是所有動物模型的最終目標。本研究利用慢病毒載體將熒光素酶基因和嘌呤霉素基因整合進入CT26細胞基因組中，我們通過提高嘌呤霉素篩選濃度，得到了高表達熒光素酶的陽性混合克隆，構(gòu)建出穩(wěn)定高表達LUC基因的CT26-LUC1細胞，重要的是膜型PD-L1表達量較CT26-WT沒有任何差異，并且在BALB/c鼠接種后第2天就能檢測到熒光信號，有利于腫瘤發(fā)生的早期研究和微小轉(zhuǎn)移灶的發(fā)現(xiàn)[28]，且中晚期腫瘤的熒光成像與腫瘤生長情況呈現(xiàn)良好的相似性，而且能夠清晰看到腫瘤的轉(zhuǎn)移，該熒光素酶移植瘤模型具有高重復(fù)性、高成瘤成功率、穩(wěn)定清晰的特點，保證了免疫檢查點抑制劑在該高表達PD-L1移植瘤的響應(yīng)[29，30]，并且能夠及時迅速敏感直接地觀測到腫瘤發(fā)生早期的治療效果。該模型還將為結(jié)腸癌發(fā)生進展機制及PD-L1靶向藥物的高通量篩選提供快速穩(wěn)定可靠的動物研究模型，并且在原位模型難以進行候選藥物的高通量評估方面提供強有力的支持，為腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)遺傳基因、腫瘤轉(zhuǎn)移機制、新抗癌轉(zhuǎn)移藥物的發(fā)現(xiàn)等提供切實可靠且價格低廉的動物模型[31]。