陳莎莎 李 均

(遵義醫(yī)科大學珠海校區(qū)中藥應用與基礎研究重點實驗室,珠海519000)

慢性腎臟病(Chronic kidney disease,CKD)患病率逐年增高,已成為全球關注的重要公共衛(wèi)生問題[1]。腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化(Epithelial mesench-ymal transition，EMT)是CKD的一個重要特征，導致腎功能受損，并最終發(fā)展為終末期腎病[2]。而目前對CKD的治療效果仍不滿意。近年來，中醫(yī)藥對防治CKD方面具有良好的臨床療效。丹參酮ⅡA(Tanshinone ⅡA)是從丹參根中提取的脂溶性活性成分，具有抗氧化、清除自由基、降低血液黏度、促纖溶、改善血循環(huán)、保護內(nèi)皮細胞等作用[3,4]。但丹參酮ⅡA抗腎間質(zhì)化方面的作用目前仍不清楚，本實驗研究丹參酮ⅡA對TGF-β1誘導的HK-2細胞轉(zhuǎn)分化的影響并探討其機制。

1 材料與方法

1.1材料 人源性腎小管上皮細胞(HK-2)株由中山大學病理生理系惠贈；丹參酮ⅡA購自上海愛立信生物科技有限公司；TGF-β1購自美國Peprotech公司；DMEM低糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶均購自美國Gibco公司；CCK-8檢測試劑盒購自日本同仁化學研究所；RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、擴增試劑盒均購自大連TaKaRa公司；兔抗人Fibronectin、Bax、Bcl-2、Caspase-3，抗兔IgG H&L(DyLight?488)均購自英國Abcam公司；兔抗人E-Cadherin、Snail、GAPDH，抗兔IgG HRP二抗、抗兔IgG H&L(Alexa Flour?555)均購自美國CST公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及分組 HK-2細胞用含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。鏡下觀察細胞密度達80%左右予以傳代。將傳代的HK-2細胞隨機分為正常組、模型組及丹參酮 Ⅱ A組；三組細胞貼壁后用無血清培養(yǎng)基同步化24 h，正常組不予特殊處理，模型組予以10 ng/ml的TGF-β1處理48 h；丹參酮 Ⅱ A組在10 ng/ml的TGF-β1基礎上加入最佳濃度丹參酮 Ⅱ A處理48 h。

1.2.2CCK-8法篩選丹參酮ⅡA藥物最佳濃度 將HK-2細胞按每孔1×104個/100 μl接種于96孔板中，待細胞貼壁后，予以無血清培養(yǎng)基同步化24 h，加入0、1、2.5、5、10、20、40、80、160 μmol/L梯度濃度的丹參酮ⅡA，藥物作用48 h后每孔加入10 μl CCK8，在37℃孵育2 h后酶標儀檢測450 nm處的吸光度(OD)值,以未加藥組為對照組，每組設置6個平行孔，重復3次，細胞增殖率(%)=實驗組的OD值/對照組的OD值×100%。根據(jù)細胞增殖率篩選藥物最佳濃度。

1.2.3RT-qPCR檢測Fibronectin、E-cadherin、Snail mRNA的表達水平 三組細胞的總RNA提取后，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應條件(37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃)，再用 SYBR Green 染料法進行實時熒光定量PCR反應。反應條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 60 s，90℃ 15 s。選擇GAPDH基因為內(nèi)參，運用2-ΔΔCt方法計算目的基因mRNA相對表達水平。引物由上海生工生物有限公司設計并合成，引物序列見表1。每組設置3個復孔，重復3次。

1.2.4Western blot 檢測Fibronectin、E-cadherin、Snail蛋白表達水平 按總蛋白試劑盒說明書提取細胞總蛋白，測定蛋白濃度；根據(jù)目的蛋白分子量配置相應濃度的SDS-PAGE膠，每孔上樣量均為 30 μg，恒壓電泳分離蛋白，采用半干法恒流將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入Fibronectin、E-cadherin、Snail及內(nèi)參GAPDH一抗(稀釋比均為1∶1 000)，4℃過夜。次日TBST洗膜后分別加入抗兔IgG HRP二抗(稀釋比均為1∶2 000)，37℃孵育1 h后TBST洗膜，用ECL發(fā)光并拍照。采用Image-Pro Plus6.0軟件對蛋白進行半定量分析。

1.2.5免疫熒光檢測Bax、Bcl-2、Caspase-3的表達 將各組細胞爬片用PBS洗滌3次，4%多聚甲醛室溫固定10 min，PBS洗滌，用0.3%Triton-X100室溫下作用15 min，PBS沖洗，用10%山羊血清室溫下封閉30 min，加入兔抗人Bax、Bcl-2及Caspase-3(稀釋比均為1∶100)4℃過夜，PBS沖洗，加入抗兔IgG H&L(DyLight?488)或(Alexa Flour?555)二抗(稀釋比均為1∶500)，室溫下孵育30 min，PBS沖洗，用含DAPI的液體封固劑封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照,采用Image-Pro Plus6.0軟件測量蛋白的IOD/Aera值行統(tǒng)計分析。

表1 引物序列

Tab.1 Primer sequence

GeneForward ReverseFibronectin5′-ATGCAACGATCAGGACACAAGGAC-3′5′-TGCCTCTCACACTTCCACTCTCC-3′E-cadherin5′-GCTCTTCCAGGAACCTCTGTGATG-3′5′-AAGCGATGGCGGCATTGTAGG-3′Snail5′-GGCTCCTTCGTCCTTCTCCTCTAC-3′5′-CCAGGCTGAGGTATTCCTTGTTGC-3′GAPDH5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′

2 結(jié)果

2.1丹參酮ⅡA藥物最佳濃度的篩選 HK2細胞在1、2.5、5、10、20、40、80、160 μmol/L不同濃度丹參酮ⅡA作用48 h后，CCK-8結(jié)果顯示(圖1)，10 μmol/L及以上濃度明顯影響細胞活性(P<0.01)，5 μmol/L及以下濃度對細胞活性無明顯影響。根據(jù)丹參酮ⅡA對HK-2細胞具有保護作用，故選擇5 μmol/L作為最佳濃度作用TGF-β1誘導的HK-2細胞。

2.2三組細胞形態(tài)的變化 光學顯微鏡觀察三組HK-2細胞形態(tài)的變化,正常組HK-2細胞呈鵝卵石樣致密排列，典型上皮樣細胞形態(tài)；模型組細胞形態(tài)呈典型長梭形，大小不一，與肌成纖維細胞相似；丹參酮ⅡA組長梭形細胞明顯減少，更接近正常組細胞形態(tài)(圖2)。

2.3三組細胞中Fibronectin、E-cadherin、Snail mRNA相對表達結(jié)果 以GAPDH為內(nèi)參，采用RT-qPCR檢測三組細胞中Fibronectin、E-Cadherin及Snail mRNA相對表達水平。結(jié)果顯示正常組、模型組及丹參酮ⅡA組Fibronectin mRNA相對表達水平分別為1.09±0.10、2.41±0.09及1.49±0.14；E-Cadherin mRNA相對表達水平分別為1.05±0.05、0.49±0.03及0.69±0.04；Snail mRNA相對表達水平分別為0.83±0.17、2.97±0.21及1.15±0.32。與正常組相比，模型組Fibronectin、Snail mRNA的相對表達增加，E-Cadherin mRNA相對表達減少(P<0.01)；與模型組相比，丹參酮ⅡA組Fibronectin、Snail mRNA的相對表達降低，E-Cadherin mRNA相對表達升高(P<0.05)，見圖3。

圖1 CCK8法檢測丹參酮ⅡA對HK-2細胞活性Fig.1 Effect of TanshinoneⅡA on cytoactive of HK-2 cells was detected by CCK8Note: Compared with control group,**.P<0.01.

2.4三組細胞中Fibronectin、E-cadherin、Snail 蛋白表達結(jié)果 以GAPDH為內(nèi)參，Western blot檢測正常組、模型組及丹參酮ⅡA組Fibronectin、E-cadherin、Snail相對表達水平分別為0.23±0.03、0.61±0.02及0.31±0.03；0.47±0.02、0.25±0.03及0.40±0.03；0.14±0.03、0.60±0.01及0.49±0.02。 與正常組相比， 模型組Fibronectin、Snail 蛋白表達增加，E-Cadherin 蛋白表達減少(P<0.01)；與模型組相比，丹參酮ⅡA組Fibronectin、Snail 蛋白表達降低，E-Cadherin 蛋白表達升高(P<0.05)，見圖3。

圖4 Western blot檢測三組細胞Fibronectin、E-cadherin、Snail 蛋白表達Fig.4 Protein relative levels of Fibronectin,E-cadherin and Snail in three groups were detected by Western blotNote: *.P<0.05,**.P<0.01.

圖5 免疫熒光檢測三組細胞中Bax的表達

Fig.5 Expressions of Bax in three groups were detected by immunofluorescence and calculated

Note: *.P<0.05,**.P<0.01.

圖6 免疫熒光檢測三組細胞中Bcl-2的表達

Fig.6 Expressions of Bcl-2 in three groups were detected by immunofluorescence and calculated

Note: *.P<0.05,**.P<0.01.

圖7 免疫熒光檢測三組細胞中Caspase-3的表達

Fig.7 Expressions of Caspase-3 in three groups were detected by immunofluorescence and calculated

Note: **.P<0.01.

2.5三組細胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3 的表達結(jié)果 采用免疫熒光檢測凋亡蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3。與正常組相比，模型組中促凋亡蛋白Bax、Caspase-3的表達明顯增加(P<0.01)，而抑凋亡蛋白Bcl-2的表達明顯減少(P<0.01)；與模型組相比，丹參酮ⅡA組Bax、Caspase-3的表達明顯降低(P<0.05)，而Bcl-2的表達明顯升高(P<0.05)，見圖5～7。

3 討論

腎小管上皮細胞EMT參與腎損傷后的病理性修復，與腎纖維化進展為CKD有關[5]。在EMT過程中，上皮細胞失去上皮極性及細胞間鏈接，細胞發(fā)生骨架重組，細胞形態(tài)和運動能力發(fā)生變化并可受多種信號通路調(diào)控，如上皮標志物E-Cadherin等發(fā)生下調(diào)及間質(zhì)標志物Fibronectin、Snail等出現(xiàn)上調(diào)[6]。Strippoli等[7]發(fā)現(xiàn)EMT過程中Fibronectin和Snail 基因激活，而下調(diào)Snail、Fibronectin的表達及上升E-Cadherin的表達能逆轉(zhuǎn)EMT過程。

轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)是導致CKD間質(zhì)纖維化的主要因素，也是腎小管上皮細胞EMT的公認誘導因子[8]。TGF-β1可降低E-Caherin的表達，促進Fibronectin、Snail的轉(zhuǎn)錄與激活，誘導腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂忻黠@肌成纖維細胞形態(tài)的細胞，如細胞極性、肌動蛋白微絲及致密體的改變，導致腎間質(zhì)轉(zhuǎn)分化[9]。Strutz等[10]用TGF-β1處理小鼠腎小管上皮NP1細胞48 h后發(fā)現(xiàn)E-Cadherin的表達降低，致密連接體產(chǎn)生的相關蛋白ZO-1減少及細胞極性的喪失。Zivotic等[11]使用TGF-β1處理腎小管上皮細胞HK-2 48 h后發(fā)現(xiàn)HK-2細胞的形態(tài)發(fā)生改變，伴隨編碼E-Cadherin的CDH1的減少及間質(zhì)標記物Snail轉(zhuǎn)錄增加。

本實驗模型組與正常組相比，細胞極性發(fā)生改變，成長梭形；上皮細胞標記物E-Cadherin mRNA和蛋白的表達均下降(P<0.01)，而間質(zhì)標記物Fibronectin、Snail mRNA和蛋白表達均上升(P<0.01)，表明TGF-β1誘導的HK-2細胞發(fā)生了轉(zhuǎn)分化過程，細胞造模成功。為了保證丹參酮ⅡA對細胞活性不受影響，我們通過CCK8法篩選出丹參酮ⅡA的最佳濃度為5 μmol/L，此濃度處理的丹參酮ⅡA組與模型組相比，長梭形細胞明顯減少，E-Cadherin mRNA和蛋白的表達均增加(P<0.01)，F(xiàn)ibronectin、Snail mRNA和蛋白表達均減少 (P<0.01)，以上結(jié)果表明丹參酮ⅡA可逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導的HK-2細胞轉(zhuǎn)分化過程。

研究發(fā)現(xiàn)細胞凋亡是腎間質(zhì)轉(zhuǎn)分化發(fā)生發(fā)展的促進因素[4,12,13]。Xu等[4]在缺血/再灌注的腎損傷(Ischemia/reperfusion induced renal injury，I/RIRI)模型大鼠中，丹參酮ⅡA預處理可通過下調(diào)Caspase-3等蛋白表達，上調(diào)Bcl-2蛋白表達來減弱腎臟炎性反應，抑制凋亡，保護腎功能。楊紫依[14]等通過體外培養(yǎng)HK-2細胞，建立缺氧/復氧模型模擬I/RIRI實驗中發(fā)現(xiàn)：丹參酮ⅡA可上調(diào)Bcl-2表達，下調(diào)Bax以及Caspase-3表達，通過抑制凋亡減輕I/RIRI保護腎功能。而EMT過程在I/RIRI梗阻性腎病中起關鍵作用[13]。本實驗，我們發(fā)現(xiàn)模型組與正常組相比，Bax、Caspase-3的表達均增加(P<0.01)，Bcl-2的表達降低(P<0.01),表明TGF-β1誘導的HK-2細胞發(fā)生了凋亡。丹參酮ⅡA組與模型組相比，Bax、Caspase-3的表達均降低(P<0.05)，Bcl-2的表達升高(P<0.05),表明丹參酮ⅡA可通過抗細胞凋亡逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導的HK-2細胞轉(zhuǎn)分化。綜上所述，丹參酮ⅡA逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導的HK-2細胞轉(zhuǎn)分化，其機制可能與抗細胞凋亡相關。