賈 鵬， 王凱悅， 亐開興， 張繼才， 黃必志， 蘇相生， 陳 宏， 雷初朝*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100;2.云南省草地動(dòng)物科學(xué)研究院，昆明 650212；3.云南省雙柏縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南 雙柏 675100)

滇中牛(曾名楚雄牛)屬于役肉兼用型品種，其中心產(chǎn)區(qū)在云南省楚雄、曲靖、大理、滇中、思茅和臨滄等地區(qū)。滇中牛遺傳性能穩(wěn)定，具有體質(zhì)結(jié)實(shí)、發(fā)育勻稱、體小力大、耐勞、性情溫順、行動(dòng)敏捷、善于爬坡等特點(diǎn)，是我國(guó)優(yōu)良的地方黃牛品種之一[1]。

Y染色體遺傳信息是對(duì)常染色體、X染色體及線粒體DNA的重要補(bǔ)充，因其遵循嚴(yán)格的父系遺傳、單倍型完整等特點(diǎn)，是研究動(dòng)物父系遺傳多樣性、起源和馴化歷史等問(wèn)題的理想工具。近年來(lái)，基于Y染色體單核苷酸多態(tài)性(Y-SNPs)和微衛(wèi)星(Y-STRs)分子標(biāo)記，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)家牛(普通牛和瘤牛)進(jìn)行了較為系統(tǒng)的父系遺傳研究，結(jié)果一致表明家牛包含3個(gè)Y染色體單倍型組(即普通牛Y1和Y2以及瘤牛Y3單倍型組)[2-3]和1個(gè)新的Y1.2單倍型組[4]，Y-SNPs標(biāo)記可以區(qū)分這3種Y染色體單倍型組，而Y-STRs可精細(xì)區(qū)分各單倍型組內(nèi)豐富的單倍型，兩種分子標(biāo)記的結(jié)合使用能夠更準(zhǔn)確地反映家牛Y染色體的遺傳多樣性與起源歷史[5]。

然而，迄今關(guān)于滇中牛品種的遺傳多樣性、起源和群體遺傳結(jié)構(gòu)的相關(guān)研究報(bào)道較少。Li等[6]分析了53頭滇中牛線粒體DNA D-loop區(qū)910 bp序列的多態(tài)性，結(jié)果表明滇中牛具有普通牛和瘤牛2個(gè)母系起源，以瘤牛血統(tǒng)為主。此外，Xia等[7]研究了滇中牛的線粒體DNA D-loop區(qū)序列，結(jié)果同樣支持滇中牛有普通牛和瘤牛2種母系起源。關(guān)于滇中牛Y染色體遺傳多樣性及父系起源的研究尚未見報(bào)道，因此，本研究對(duì)滇中牛2個(gè)Y-SNPs(UTY19和ZFY10)和Y-STRs(INRA189和BM861)進(jìn)行測(cè)序和綜合分析，以期從分子水平分析滇中牛父系遺傳多樣性、起源和群體遺傳結(jié)構(gòu)，為今后開展該品種的保種、選育策略制定和分子育種提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與基因組DNA提取

在云南省楚雄市雙柏縣采集27頭滇中公牛的耳組織樣帶回實(shí)驗(yàn)室，采用苯酚—氯仿方法提取全基因組DNA，提取的基因組DNA稀釋成10 ng/μL放在-20 ℃保存?zhèn)溆?。用?shí)驗(yàn)室保存的5頭荷斯坦牛公牛(屬于典型的Y1單倍型組)DNA做對(duì)照。

1.2 引物合成與PCR擴(kuò)增

參照Ginja[2]等和G?therstr?m[3]等報(bào)道的2個(gè)家牛Y-SNP標(biāo)記(UTY19和ZFY10)引物序列信息合成引物，參照Edwards等[8]發(fā)表的2對(duì)Y-STR標(biāo)記(INRA189和BM861)引物序列信息合成引物。PCR反應(yīng)體系為12.5 μL：ddH2O 5.00 μL，2×Taq MasterMix 6.00 μL，上下游引物各0.25 μL(10 pmol/μL)，模板DNA 1.00 μL。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，53～56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，36個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。用2%的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，將檢測(cè)合格的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序與熒光分型。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)合已經(jīng)發(fā)表的家牛序列(GenBank登錄號(hào)分別為AY936543和AF928827)，將UTY19和ZFY10的測(cè)序結(jié)果用SeqMan v7.1軟件進(jìn)行比對(duì)分析，找出相應(yīng)的SNP位點(diǎn)。用GeneMarker V1.91軟件對(duì)熒光微衛(wèi)星標(biāo)記INRA189和INRA189的等位基因大小進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。由于不同酶對(duì)微衛(wèi)星結(jié)果會(huì)產(chǎn)生1～2 bp的影響，所以本研究同時(shí)使用荷斯坦牛微衛(wèi)星數(shù)據(jù)做矯正，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。每個(gè)個(gè)體的單倍型都是利用Y-SNPs先確定家牛的單倍型組，繼而結(jié)合Y-STRs的分型結(jié)果，二者共同確定出每頭牛的Y染色體單倍型(Y-SNP-INRA189-BM861)。 用ARLEQUIN V3.0軟件計(jì)算單倍型頻率和單倍型多樣度(H±SD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Y-SNPs多態(tài)性

利用2個(gè)Y-SNPs標(biāo)記(UTY19和ZFY10)對(duì)27頭滇中牛的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果與Ginja等[2]和G?therstr?m等[3]報(bào)道的家牛序列(GenBank登錄號(hào)：AY936543和AF928827)進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明：UTY19標(biāo)記在27頭滇中牛全部為A堿基，ZFY10標(biāo)記在27頭滇中牛存在C和T兩種堿基(表1)。參考Ginja等[2]和G?therstr?m等[3]對(duì)家牛Y染色體單倍型組的判定標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)2個(gè)標(biāo)記的核苷酸變異確定單倍型組，結(jié)果顯示，27頭滇中牛存在Y2(22.22%)和Y3(77.78%)2種Y染色體單倍型組，沒(méi)有Y1單倍型組。

2.2 Y-STRs多態(tài)性

利用2個(gè)Y-STRs標(biāo)記(INRA189和BM861)對(duì)27頭滇中牛進(jìn)行Y染色體微衛(wèi)星多態(tài)性檢測(cè)，在INRA189座位中共檢測(cè)到88 bp和90 bp共2種等位基因，88 bp對(duì)應(yīng)瘤牛Y3單倍型組，90 bp在普通牛和瘤牛2種單倍型組中均存在，在這27頭滇中牛中僅有3頭滇中牛檢測(cè)到88 bp的等位基因，其余24頭滇中牛均檢測(cè)到90 bp的等位基因；在BM861座位中檢測(cè)到2種等位基因(156 bp和158 bp)，156 bp和158 bp分別對(duì)應(yīng)瘤牛Y3和普通牛Y2單倍型組。在BM861座位中，滇中牛有6頭屬于普通牛Y2單倍型組的158 bp等位基因，有21頭屬于瘤牛Y3單倍型組的156 bp等位基因(表1)。對(duì)照組荷斯坦牛在INRA189座位中均為98 bp等位基因，在BM861座位中僅檢測(cè)到屬于普通牛Y1單倍型組的等位基因158 bp。

表1 滇中牛Y染色體單倍型與單倍型頻率

2.3 單倍型頻率和單倍型多樣度

參照Edwards等[5]報(bào)道的Y-SNPs和Y-STRs標(biāo)記結(jié)合的單倍型分型方法，對(duì)27頭滇中牛的單倍型進(jìn)行分析(Y-SNP-INRA189-BM861)。27頭滇中牛存在普通牛Y2(Y2-90-158)和瘤牛Y3(Y3-88-156和Y3-90-156) 2種單倍型組，其中Y2-90-158、Y3-88-156和Y3-90-156的單倍型頻率分別為0.222 2，0.111 1和0.666 7，滇中牛的Y染色體單倍型多樣度為0.5128±0.0904。所有荷斯坦公牛都是Y1-98-158單倍型。

3 討 論

云南地處中國(guó)與南亞、東南亞接壤的邊境地帶，云南地方黃牛存在普通牛和瘤牛2種血統(tǒng)來(lái)源。因此，云南一些地方黃牛品種是普通牛和瘤牛的雜交后代[6]。據(jù)推測(cè)，印度瘤?？赡芙?jīng)過(guò)云南進(jìn)入中國(guó)，云南滇中牛即是由中國(guó)瘤牛和印度瘤牛雜交而成[9]，是云南省滇中地區(qū)群眾在長(zhǎng)期的生產(chǎn)、生活中通過(guò)自然與人工選擇而成的優(yōu)良地方黃牛遺傳資源。然而，迄今為止，尚未見分子水平上對(duì)滇中牛品種的父系遺傳多樣性、起源和群體遺傳結(jié)構(gòu)的相關(guān)研究報(bào)道。因此，本研究對(duì)27頭滇中牛的Y-SNPs(UTY19和ZFY10)和Y-STRs(INRA189和BM861)遺傳多樣性進(jìn)行研究。

家牛Y-SNPs和Y-STRs標(biāo)記當(dāng)前已被廣泛用于世界牛品種/群體的遺傳多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)、起源和遷徙路線等研究。在對(duì)國(guó)外家牛品種/群體的研究中，Ginga等[2]對(duì)多個(gè)歐洲家牛品種的分析表明，歐洲牛為普通牛起源，Y1單倍型組主要分布在北歐牛品種中，Y2單倍型組主要分布在南歐牛品種中。隨后，Pérez-Pardal等[10]在45個(gè)歐洲和非洲牛群體中檢測(cè)到Y(jié)1和Y2兩種單倍型組，細(xì)分為38種單倍型。Edwards等[5]通過(guò)分析138個(gè)歐洲和亞洲牛品種也表明歐洲牛只擁有普通牛Y染色體單倍型組，其中Y1主要出現(xiàn)在北歐和西北歐，但在多個(gè)伊利比亞牛品種和西南亞牛品種中也有零星分布。

而在國(guó)內(nèi)黃牛品種的父系遺傳分析中，常振華等[11-12]等先后對(duì)中國(guó)16個(gè)地方黃牛品種進(jìn)行了父系遺傳多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)及起源分析，結(jié)果一致表明北方黃牛以Y2單倍型組為主，南方黃牛以Y3單倍型組為主，中原黃牛含普通牛Y2和瘤牛Y3單倍型組。為了準(zhǔn)確判斷每一個(gè)品種的單倍型多樣性及其父系起源，Xia等[7]分析了34個(gè)中國(guó)黃牛品種/群體的Y-SNPs和Y-STRs多態(tài)性，研究結(jié)果表明，中國(guó)黃牛保持著高度的父系起源多樣性，并且可能擁有許多起源于近東馴化中心的原牛血統(tǒng)。

在本研究中，筆者對(duì)滇中牛2個(gè)Y-SNPs(UTY19和ZFY10)和Y-STRs(INRA189和BM861)進(jìn)行父系遺傳分析。研究表明滇中牛由普通牛Y2和瘤牛Y3單倍型組組成，以Y3單倍型組為主。這與侯佳雯[13-15]等對(duì)安徽皖南牛、大別山牛、廣西潿洲牛等部分南方黃牛的研究結(jié)果基本一致，說(shuō)明滇中牛具有與中國(guó)南方黃牛品種相似的父系遺傳組成，即以瘤牛Y3單倍型組為主。此外，也與Li[6-7]等基于線粒體DNA D-loop區(qū)對(duì)滇中牛母系起源的研究結(jié)果相吻合。

單倍型多樣度是衡量一個(gè)群體變異程度的重要指標(biāo)，單倍型多樣度高的群體說(shuō)明其遺傳多樣性高，遺傳資源豐富。在本研究中，27頭滇中牛的Y染色體單倍型多樣度為0.5128±0.0904，可以看出該值低于Xia等[7]報(bào)道的34個(gè)中國(guó)黃牛品種的整體Y染色體單倍型多樣度的平均值(0.607±0.016)，但高于國(guó)外牛品種的Y染色體單倍型多樣度平均值(0.422±0.3)[5]，表明滇中牛的Y染色體單倍型多樣度和分子遺傳多樣度相對(duì)較高。本研究對(duì)滇中牛遺傳資源的保護(hù)和利用提供了科學(xué)依據(jù)。